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构建p53表达载体(2)—— PCR酶切回收

真·科研狗      10-11 10:46      3058      4

在上一节教程中我们已经设计好构建p53表达载体的引物:

构建p53表达载体(1)——引物设计

现在引物已经到手~在这里我们接着做。

1. 将引物配成溶液

     我们从引物公司订购回来的引物一般使用EP管包装的粉末状,一般量为2OD,因为非常少,所以肉眼仅可见。在随同发过来的引物外一般还有一张说明书,是对引物的描述,有引物的长度,退火温度,需要加多少ddH2O。

    在打开引物的EP管盖之前一定要离心一下,让漂浮在EP管仲的引物粉末沉降下去。然后我们按照说明书添加对应体积的ddH2O(至于加什么水,本科研狗什么水都加过,高压水,dH2O,甚至自来水,当然最好是用比较纯的水,水中的离子会影响PCR酶)。引物的储存液一般是配成100mM,我们再从里面配出一些工作液10mM,然后把储存液放置-20度保存(避免反复冻融)。


2. 提取细胞的总mRNA

我们从细胞中提取总mRNA,提取mRNA 的方法一般是用Trizol方法提取,RNA的提取方法可以查看科研狗网站http://www.keyangou.com/protocol/show/193?c=d45ad40878a8e7cbf83a55fb3dd7a6dd

注意,p53在很多肿瘤细胞中存在突变,因此需要选择没有突变的细胞,(最后我们将测序验证构建的质粒是否有突变)。


3. 将提取的总mRNA 逆转录成cDNA,这里我们采用试剂盒。

步骤在如下链接:

http://www.keyangou.com/protocol/show/255?c=955b31b536151cb38bb2be87b94b75bf


4. 采用步骤1里面的引物对步骤3里面的cDNA进行PCR,根据PCR使用的酶厂家不一致,调整Buffer和水,下面仅仅是一个例子:

Primer-forword:         10mM          0.5ul

Primer-reverse:         10mM          0.5ul

2xBuffer:                      -                  12.5ul

dNTP:                         2.5mM          3ul

template                     50ng/ul          2ul

DNA聚合酶                 -                   0.5ul

H20                                                   6ul

总体积                                              25ul

根据你使用的PCR反应体系调整,第一次PCR可以对模板浓度做一个梯度,比如50ng, 100ng, 500ng。 退火温度为Tm-5度。延伸时间一般为1kb长度对应1分钟,p53大约有1500个碱基,那么延伸时间设置为1分钟30秒,总共35个循环。


5. PCR结束之后,需要跑DNA琼脂糖胶进行分析,pcr产物大概在1500bp,我们使用0.8%或者0.1%的琼脂糖胶。Marker使用1Kb的marker.。步骤可以见下面的protocol:

http://www.keyangou.com/protocol/show/12?c=368294d171466ce012b6df4de2654618

琼脂糖跑胶大约需要20分钟到30分钟,之后我们在凝胶成像系统下观察PCR产物是否扩增出来了p53的片段。


6. 接下来我们选取步骤4里面最好的条件,再PCR三管。然后我们把所有的PCR产物用琼脂糖凝胶跑胶回收。步骤见下面的protocol:

http://www.keyangou.com/protocol/index?w=回收

最后一步回收DNA时一定是用水溶解的,不要使用TE,因为TE会对后面的酶切产生影响。


7. 回收结束之后用仪器测浓度,如果没有很好的仪器,也可以直接跑胶估测浓度,一般的marker上5ul,最亮的条带为100ng,其他的条带为50ng,可以根据条带亮度估计。回收的DNA片段最好总量超过2ug。

 

8. 采用我们先前设计的两个酶XhoI和NotI分别对回收之后的PCR产物和PCI-neo质粒进行酶切。酶切一般的总体积为30ul,如果你的PCR产物回收之后浓度比较低,可以总体积为50ul,酶切体系最好是在0.2ml 的PCR管里面进行,放置于37度水浴过夜(16h)酶切体系如下:

 

9. 第二天,把PCR产物管和载体管立即分别进行琼脂糖凝胶电泳回收,参考第6步。回收之后依然测下浓度。有的人员喜欢加上CIP酶处理,本科研狗一直没加,可以看看自己情况添加。

注意:在跑质粒的时候可以在琼脂糖旁边上一个没有经过酶切的质粒对照,质粒经过双酶切之后变成线性的了,PCI-neo载体总碱基数大约为5500个,如果经过酶切之后,在琼脂糖上面的位置也应该在5500左右,没有经过酶切的质粒是超螺旋结构,应该在3000-4000左右。另外即使跑出来的条带在5500左右,也只能证明其至少被一个酶切开,我们不能判断其是否被两个酶同时切开。


10. 接下来就是连接,我们需要把p53DNA片段连入PCI-neo上面。我们使用T4 DNA ligase,连接体系如下。

 

注意:载体和DNA片段的数目比最好在1:31:10 , 是数量比,不是质量比,PCI-neo载体大小为5500, p53DNA片段约为1500,因此上图中所加的片段比为1:7。连接的DNA总量不要超过100ng


11. 四度过夜连接之后,进行转化涂板,我们一般用热激法进行性转化,采用的是大肠杆菌DH5a,我们将所有的10ul连接产物转化。转化的步骤可以查看如下protocol:

http://www.keyangou.com/protocol/index?w=转化

http://www.keyangou.com/protocol/show/3?c=3fae960be1b280855934864f3c1fed89

 

12. PCI-neo是氨苄抗性质粒,因此我们选择把转化后的产物涂在含有100ug/ml的氨苄菌板上,然后37度细菌孵箱过夜。


13. 第二天会在菌板上长出克隆,如果克隆不够大,可以继续放在37度,如果已经很好,但是又不想立即挑克隆摇细菌,可以放在四度。取15ml玻璃摇菌管6只,加入带50ug/ml氨苄抗生素的LB培养液5ml,挑取6个克隆,37度摇床过夜。


14. 接下来可以直接送菌液测序,不过最好是先取1ml菌液小提质粒,然后跑胶之后确认质粒位置正确后送测序,小提的步骤protocol如下:

http://www.keyangou.com/protocol/show/1?c=4eee3765d1d0e1038810d75e21af07b8

测序的时候需要提供测序引物,如果你写明载体为PCI-neo载体,测序引物可以直接写通用引物。一个测序引物能够测出800bp左右的序列,p53载体有1500个,那么写双向测,两个反应则可以把p53测通。


15. 等待一至两天后结果会发送到你的邮箱,就可以进行序列比对,序列比对可以采用多种软件比如clusterX,也可以使用NCBI网站,序列比对我们将在以后的章节中介绍。


至此两节教程介绍了从如何设计引物到最后的测序~希望对大家有所帮助。


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  • QQ小丸酱 发布于:2015年12月07日 18:25:30

    关于质粒酶切的图最好最为例子放上去哦,感觉这样更直观

  • mrrchen 发布于:2016年01月19日 15:37:27

    赞赞赞赞赞赞。。。

  • 华丽血时代爱 发布于:2017年04月15日 10:02:53

    连接之后跑胶的条带应该是多大呢?

  • lulu Chen 发布于:2018年06月27日 15:13:38

    大赞,楼主的教程太有用了


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