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QPCR结果分析(一)

真·科研狗      12-03 16:29      13059      1

假设我们有一个药物,加入细胞培养液中看他对于p53mRNA水平的影响,那么如何设计实验组和对照组呢?如何分析结果?


实验设计
分别种两小皿(3.5cm)细胞,一皿加药,另外一皿加对照。处理一段时间之后,分别收细胞提RNA,逆转录,然后准备做qPCR,这个时候我们需要做的qPCR孔如下:
注意这里面要区别一个概念是“独立实验重复”和“PCR重复”,上面p53和GAPDH都有三个PCR孔,这是PCR重复,为了消除本次操作误差引的。独立实验重复指的是我们做的三次独立的重复试验,具体到本例中,就要求我们在其他时间做再种两小皿细胞,再提mRNA,再逆转录,再做qPCR,如此做了三次实验后才能算作独立实验重复,我们统计的时候统计的是独立实验重复,而不能单纯以上面三个孔作为统计误差的来源。
做完上述实验之后,我们得到如下的结果(下图中值均为Ct值):

第一次独立实验Test1
我们再做两次独立重复试验,得到结果如下:

第二次独立实验Test2

第三次独立实验Test3


结果分析


下图为计算过程,是qPCR计算的核心所在,大部分同学都在此处不知如何计算

△Ct=Ct(p53)-Ct(GAPDH);
这里需要注意的是2^-△△Ct的计算,首先我们把对照里面的2^-△Ct求平均(上图中为0.000780573),然后用2^-△Ct 中的每一个数据除以这个数据,对照组也同样除。
接着我们再整理下数据:

那么这个就可以画出柱形图了~

虽然偏差都有了,虽然看上去相差那么大,如何确定P值呢。我们可以采用SPSS统计软件来统计P值,在此就不再说明,需要强调的是我们要确定用什么检验方法来检验显著性差异,因为我们是都是独立的样本,所以我们采用独立样本t检验方法来检验。SPSS的使用方法在这就不介绍了。(可以登录科研狗网站http://www.keyangou.com)。
最后强调下,这种方法只适用于单因素处理比较,这个因素(本例子中为加药)处理得到的结果应该是稳定的(表示在相同细胞中加相同浓度的药物,p53mRNA的变化水平也是一致的)。
在临床上我们经常会做到比较癌和癌旁中某种基因mRNA水平的差异,这种不能用上面方法,因为个体差异非常大,每个人的癌和癌旁都不一样,不能把每个人的癌和癌旁当作是独立实验的重复(Test1,Test2,Test3...),我们将在下一讲中介绍。


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  • 拥日之月 发布于:2019年03月24日 23:36:21

    三组及以上该怎么分析呢?谢谢


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