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琼脂糖凝胶电泳实验

2014-11-18 1326 收藏

实验原理

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是:它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。   琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,现广泛应用于核酸的研究中。   蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷,在电场中受力大小不同,因此跑的速度不同,根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间,离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100 bp的DNA片段,其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低,但它制备容易,分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20 kb,利用脉冲电泳,可分离高达107 bp的DNA片段。   DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

实验材料

  • DNA
  • 琼脂糖
  • TBE电泳缓冲液
  • 电泳载样缓冲液
  • 溴化乙锭(EB)溶液母液
  • DNAGreen
  • 实验仪器

  • 水平式电泳装置
  • 电泳仪
  • 台式高速离心机
  • 恒温水浴锅
  • 微量移液枪
  • 微波炉或电炉
  • 紫外透射仪
  • 照相支架
  • 照相机及其附件
  • 实验步骤

    一、试剂配制

    1.  5×TBE缓冲液:450 mmol/L Tris-硼酸,10 mmol/L EDTA,pH值8.0。使用时将上述储存液稀释10倍至0.5×TBE缓冲液,可同时作为电泳及制胶用的缓冲液。

    二、制胶

    1.  根椐制胶量及凝胶浓度,在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中,加入准确称量的琼脂糖粉(总液体量不宜超过锥瓶的50%
    容量)。琼脂糖粉末与0.5×TBE buffer的比例(w:v)参考表1,常用琼脂糖浓度为0.7-1%。

    表1  琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围


    琼脂糖浓度 最佳线形DNA分辨范围(bp)
    0.50%  1 000~30 000
    0.7%   800~12 000
    1% 500~10 000
    1.20% 400~7 000
    1.50% 200~3 000
    2% 50~2 000
    2%~5% 20~1 000


    2.  在锥瓶的瓶口上盖上保鲜膜或牛皮纸,并在膜或纸上扎些小孔,然后在微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时,当溶液沸腾后,请戴上防热手套,小心摇动锥瓶,使琼脂糖充分均匀溶解。此操作重复数次,直至琼脂糖完全溶解。

    3.  使溶液冷却至50℃-60℃左右,如需要可在此时加入溴化乙锭溶液(终浓度0.5  μg/ml)或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料,并充分混匀。

    4.  将琼脂糖溶液倒入制胶模中,然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3~5 mm之间。制胶模如下图所示,小胶倒入25-30 mL左右琼脂糖溶液,大胶则60-70 mL左右,若需切胶回收,凝胶可适当加厚。

    5.  在室温下使胶凝固,大约30分钟~1小时。
     

    三、上样

    1.  取适量样品与6×上样缓冲液混匀(如:1 μl样品与5 μl 6×上样缓冲液),用微量移液枪小心加入样品槽中。

    2.  上样量根据样品浓度可适当调整,若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量(一般小孔40 μl 为上限,大孔200 μl 为上限,具体和制胶膜规格相关)。
     
    3.  每加完一个样品要更换枪头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

    四、电泳

    1.  加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在110 V,电流在40 mA以上。

    2.  当条带移动到距凝胶前沿约2 cm时(约40 min),停止电泳。

    3.  紫外下拍照并观察。
    注意事项
    1.  5×TBE缓冲液放置时间过久会沉淀,因此一次性不要配太多。工作用电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液,取5×TBE缓冲液贮存液稀释,现配现用。

    2.  用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。

    3.  琼脂糖粉在微波炉中加热时间不宜过长,每次当溶液起泡沸腾时停止加热,否则会引起溶液过热暴沸,造成琼脂糖凝胶浓度不准,也会损坏微波炉。溶解琼脂糖时,必须保证琼脂糖充分完全溶解,否则,会造成电泳图像模糊不清。

    4.  凝胶不立即使用时,请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存,一般可保存2~5天。
     

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