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TRIzol RNA提取方法

2013-02-21 1787 收藏

实验原理

Trizol是直接从细胞或者组织中提取总RNA的试剂,内含异硫氰酸胍、酚等物质。异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出来的核酸酶,保持RNA的完整性。在酚和氯仿的作用下离心,样品分为水相层和有机层,RNA存在于水相层中。收集上面的水相层后,用异丙醇回收 RNA.

实验材料

  • 细胞样品
  • TRIzol试剂
  • 氯仿
  • 异丙醇
  • 75%乙醇
  • DEPC H2O
  • 实验仪器

  • 离心管
  • 离心机
  • 实验步骤

          RNase酶非常稳定,是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。  RNase的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。   

    1.  料制品的处理  

     尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明RNase-Free 的塑料制品,如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下:   

    (1)  在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意:DEPC为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用。  

    (2)  处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

    (3)  在通风柜中室温处理过夜。  

    (4)  将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

    (5)  烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。   

    璃玻和金属物品  250°C烘烤3小时以上。  

    2. 从组织中提取总RNA  

    (1)  液氮研磨:组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol,转入离心管进行第2步操作。   

    (2)  匀浆:组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外,组织体积不能超过Trizol体积的10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。   

    3.  从细胞中提取总RNA  

    (1)   培养贴壁细胞:不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按10cm2/ml比例加入。  

    (2)   悬浮细胞可直接收集、裂解,每1ml Trizol可裂解5×10e6动物、植物或酵母细胞,或10e7细菌细胞。   

    4.  操作步骤  

    (1)  细胞或组织加Trizol后,室温放置5min,使其充分裂解。注:此时可放入-70℃长期保持。  

    (2)  12,000rpm 离心5min,弃沉淀。  

    (3)  按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,振荡混匀后室温放置15min。注:禁用漩涡振荡器,以免基因组DNA断裂。  

    (4)  4℃ 12,000g离心15min。  

    (5)  吸取上层水相,至另一离心管中。注:千万不要吸取中间界面;若同时提取DNA和蛋白质,则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA,则弃下层酚相。  

    (6)  按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀,室温放置5-10min。  

    (7)  4℃ 12,000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底。  

    (8)  按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀。  

    (9)  4℃ 8,000g离心5min,尽量弃上清。  

    (10)  室温晾干或真空干燥5-10min。 注:RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。  

    (11)  可用50ul H2O,TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品,55-60℃,5-10min。

             注意:H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。  

    (12) 测O.D值定量RNA浓度。

             注意:此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间;产率估计:组织标本:(ug RNA/mg组织)1-10ug,培养细胞(ug RNA/10e6 Cell):5-15ug。 组织或细胞量过少,可酌情减少Trizol用量;组织或细胞用量过多,会引起DNA对RNA的污染;高蛋白、脂肪或多糖类组织,肌肉组织或块状植物组织等,组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物,再进行下面操作,若顶层有脂肪物,则也须去掉;热天提RNA,带手套是必须的,手是RNase的主要来源;组织块用液氮研磨,效果最好,若没有液氮或电动匀浆器,可用手动匀浆器代替,此时组织块不宜过大,且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎,然后再充分研磨。   

    5. 肝脏、肠道、肌肉总RNA提取方法 

    (1)  使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从鱼的腹部解剖开,从中取出完整的肝脏、肠、肌肉等组织,置于离心管后立即放入液氮中; 

    (2)  组织在液氮下研磨成粉,取少量至加有1mLTrizol的1.5ml离心管中,充分混合后于4℃,12,000rpm离心15min; 

    (3)  取上清移至新1.5ml离心管中,加入200ul氯仿,剧烈震荡直至呈乳白色,于4℃,12,000rpm离心15min; 

    (4)  取上清移至新1.5ml离心管中,加入500ul异丙醇,轻轻颠倒10次,冰上放置20mins,于4℃,12,000rpm离心15min; 

    (5)  弃上清,加入1ml75%乙醇(用DEPC水现配现用),于4℃,12000rpm离心5min,重复此步骤一次; 

    (6)  弃上清后,室温干燥5-7mins; 

    (7)  加入适量(20-30ul)的DEPC水溶解沉淀65℃溶解,-20℃(最好-80℃)保存,检测RNA浓度,并电泳检测。 

    6. RNA浓度测定和电泳检测 

    取2ul提取好的RNA溶液,于Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter测定RNA浓度及A260/A280的相对吸光度,纯净RNA的A260/A280应在1.8-2.2之间。 

    电泳检测:1%琼脂糖,1×ATE缓冲液,90V电泳30min,凝胶成像系统观察,分析结果。  

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