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DNA定点突变实验

2014-11-10 1176 收藏

实验原理

定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组,也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化),包括碱基的添加、删除、点突变等。 单点突变的原理是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提得到质粒。设计一对包含突变位点的引物(正、反向),和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”,(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物,一圈后回到引物5’端终止,再经过反复加热褪火延伸的循环,这个反应区别于滚环扩增,不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物,由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌,是经dam甲基化修饰的,对DpnI敏感而被切碎(DpnI识别序列为甲基化的GATC,GATC在几乎各种质粒中都会出现,而且不止一次),而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开,因此在随后的转化中得以成功转化,即可得到突变质粒的克隆。 多点突变的原理是准备多个带突变的引物(同方向,对同一单链模版),退火后全部突变引物(不超过5个)都结合在同一环状单链模版,PfuTurbo聚合酶延伸,碰到下一个引物就停止,各片断经连接成环,和单链模版组成杂和环,Dpn I消化双链模版,也消化杂和环中的模版,只留下新合成的带多个突变的单链环(mutant ssDNA),得以转化E.coli,形成双链质粒。资料表明,引入3个定点突变的效率为60%,5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒,以引入3个定点突变为例,就是有40% 左右的转化质粒是带有1-2个不同定点突变的质粒(因为存在1-2个引物结合模版延伸形成单链环的可能)。   一、经验分享

1.  实验的目的应该比较明确吧:就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做:
 
第一:我们吊出来的基因有点突变,相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来,并装进了自己的载体,却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配,然后暴昏。
 
大家实验室里面还是用Taq酶为主吧,Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧,Taq酶的优点和缺点都很明显:优点就是扩增效能强,缺点就是保真性差,其错配机率是比较高的,相关数字忘了,大家可以去网上查那个数字,不过感觉如果是2000bp的基因,如果扩四五十个循环的话,很大机率会出现点突变,当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系,详细情况这里就不讨论了。
 
第二:要研究基因的功能,在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列,或者改造成不同的亚型,总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要,相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。
 
对于第一种情况:我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置,如果不是很重要,大可不必管它,比如说是三联密码子的最后一位,碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变,那么一般情况下也可以不去理它。另外,在NCBI上人类的基因的版本一直在变化,也就是说同一个基因有不同的版本,或者称不同的亚型,其碱基序列有些许的差异,只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配,一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱,那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了,不过最好换个保真性好一点的酶如PFU,或者PCR循环数低一点,不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。
 
对于第二种情况:这种情况下一般也就只能做定点突变了。
 
接下来开始聊一聊定点突变的原理吧,那个Stratagene试剂盒!上面有一个说明书,说得好像很正规,不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话,看都不看,我们简明扼要地只讲实验方面,通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的PCR产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了。
 
2.  大家马上就会想到几个问题了:
 
第一:引物怎么设计呢?
 
第二:模板怎么去掉呢?
 
第三:怎么拿到质粒呢?
 
对于第一个问题:怎么设计引物?
 
我只能讲一些原则,并举一些例子。
 
引物设计的原则其它贴子上都有讲,这里就不重复了:
 
不过这种突变引物要加上一个原则:
 
一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为11-12base pair。
 
若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,大家应该都知道,引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个base pair,并且合成多一条反向互补的引物。
 
这么说大家可能不是很清楚,那我就举个例子吧:
 
X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960
 
现有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924
 
*********************************************** ************
 
|------>deletion
 
X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020
 
现有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984
 
************************************************************
 
(上面为目的序列,下面为现有序列:我们发现有一个A碱基的缺失,其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配)
 
我们以它为中心设计引物:两边各至少12个碱基,左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低,故拉长引物使GC%含量不至过低,也使引物退火温度升高。
 
故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG
 
并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG
 
其实也不一定要反向互补序列,只要反向引物也是两边都有大于12个碱基,同时符合引物设计的原则就行了。
 
引物合成公司有很多家,大家可以去寻找,不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别,不过价钱一般都是一块多一个碱基,合成时间约为一周。
 
这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了,得到的PCR产物是一条链完整,另一链有缺刻的PCR产物
 
对于第二个问题:
 
怎么去掉模板呢?再简单的方法就是用DpnI酶,DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株),而PCR产物都是没有甲基化的,所以DpnI酶能够特异性地切割模板(质粒)而不会影响PCR产物,从而去掉模板留下PCR产物,所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株,不会那么凑巧吧,哈哈。
 
关于第三个问题:
 
直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了,呵呵,然后再筛选出阳性克隆,并提出质粒,拿去测序(这个就不用我多说了吧),验证突变结果,一般都没问题的啦,我做了几十个突变了,到目前为止还没有做不出来的,呵呵,不要砸我啊。
 
下面讲一下具体的实验步骤以及一些实验中要注意的事情:
 
1、 根据现有基因设计引物;
 
2、 合成引物并准备好模板;
 
3、 PCR,
 
4、 DpnI处理酶切产物;
 
5、 转化酶切产物;
 
6、 筛选 阳性克隆;
 
7、 送测序并测全长。
 
 
 
 

实验材料

  • DNA
  • pyrobest DNA聚合酶
  • DpnI
  • 去离子水
  • BSA
  • 大肠杆菌DH5a菌株
  • 实验仪器

  • PCR仪
  • 离心管
  • 移液枪
  • 枪头
  • 枪头盒
  • 水浴锅
  • 灭菌锅
  • 培养箱
  • 实验步骤

    一、引物设计

    每条引物都要携带有所需的突变位点,引物一般长25~45 bp,设计的突变位点需位于引物中部。
     
    二、反应

    1.  使用高保真的pyrobest DNA聚合酶,循环次数少,一般为12个循环。
     
    2.  反应体系:
     
    (1)10x pyrobest Buffer: 5 ul
     
    (2)dNTP Mixture(10 mM) :1 ul
     
    (3)模板DNA(5~50 ng) :1ul
     
    (4)primer 1 (125 ng) :1 ul
     
    (5)primer 2 (125 ng) :1 ul
     
    (6)pyrobest DNA polymerase(TaKaRa)(5 U/ul):0.25 ul
     
    (7)加无菌蒸馏水至50ul.
     
    三、产物沉淀纯化

    1.  加1/10 体积的醋酸钠,1倍体积的异丙醇,混匀置冰上(或-20℃冰箱)5min,离心弃上清。

    2.  70~75%乙醇洗盐两次,烘干后溶于无菌水中(此步可省略,直接用 DpnI酶切)。
     
    四、DpnI酶切

    1.  酶切体系

    (1)Buffer :2 ul
     
    (2)BSA(100╳):0.2 ul
     
    (3)DNA :x ul
     
    (4)DpnI:0.5 ul
     
    (5)加无菌去离子水至 20 ul。
     
    2.  30℃酶切 1~4 h。

    3.  65℃水浴15min 终止反应。
     


    将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株,利用抗生素筛选突变子。
     
    六、测序验证
    注意事项
    1.  引物和质粒都准备好后,当然就是做PCR喽,不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的,我们做PCR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K,所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增,防止引进新的突变。
     
    2.  Quick change试剂盒分为几种不同的类型,QuikChange&reg、Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange&reg、 XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒(>8kb)从原理上是一样的,只是PCR的酶和BUFFER不一样,后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了,没什么特别的东西。
     
    3.  DpnI处理的时间最好长一点,最少一个小时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败。
     
    4.  实验板长出来的菌有两种可能,一种是质粒DPNI没处理干净长出来的(模板),一种是PCR产物转化出来的(突变体),不过这两种菌长得一模一样,即使提出质粒来也是一样(酶切和PCR都无法区分),除了测序,是分不出来的。

    5.  做PCR时也最好做一个负对照(不加引物),实验管由于PCR时有引物,所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物,而对照管由于PCR时没放引物,所以在DPNI处理前里面只有模板。如果两者都拿去DNPI处理,就能够证明模板已经被去除干净。若实验顺利的话应该是:正对照长菌负对照不长菌。如果出现正负对照都长菌,那么就是DpnI没处理好,如果正负对照都不长菌,那么有两种可能,一种是PCR阴性,也就是说PCR出问题了,另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题,跑胶说明不了问题,那就做个转化的对照,拿试剂盒的对照实验去试感受态,马上就能知道转化有没问题。

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