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ChIP protocol 最强总结

2016-03-23 1010 收藏

实验原理

染色质免疫共沉淀技术的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。

实验步骤

一,    细胞固定 (离心机预冷,化COCKTAIL

1.    1ml细胞加入27 ul 37%甲醛,迅速混匀,室温慢摇,固定。 固定时间:组蛋白,8-1分钟;HAFLAG15-20分钟;一般的转录因子:30分钟左右

2.    加入10X甘氨酸22.2ml (B) 除去甲醛,室温慢摇5min。(甘氨酸的终浓度1X

3.    2000rpm2min,吸走上清。

4.    加入1mlPBS重悬,吹打混匀,转移到1ml的离心管中。4°C2000rpm2min,吸走上清。

5.    再次加入1mlPBS重悬。 4°C2000rpm2min,吸走上清。沉淀可冻存于负80度。

TIPS1,包括以下步骤,PBS中加入一些蛋白酶抑制剂Cocktail2注意固定温度25度左右,冬天温度太低,可以放在杂交炉。3,超声样品要放在放冰水混合物中,随时注意加冰。

 

二,    超声破碎DNA

1.    要做预实验摸超声条件,取20ul核裂解液,加入1ul蛋白酶k20mg/mL),65孵育至少6h,加入1ul RNase A37 30min。电泳检测染色质超声片段的大小应在2001000bp之间为最佳。

2.     离心机预冷,化Cocktail

3.     每管加入500ul细胞裂解液和Cocktail 4°C转床5分钟。

4.     4°C2000rpm5分钟,吸走上清。

5.     每管加入500 ul核裂解液,超声。(不同细胞可能会加入不同量的核裂解液,看要分成多少份了 )。

6.     4°C12000g10min。将上清液转移至另一离心管。测浓度,应大于 1ug/ul (超声液可以冻存在-80度。我做pol2的抗体,浓度只有100ng/ul,也能拿到很好的结果。抗体不好用的话,最好保证超声液的浓度)。

 

三,    免疫沉淀

1.    超声后将超声液都混在一起混匀,用412500g离心10min,取上清。然后再分成不同等份加抗体。

2.     每次做免疫沉淀至少应该有阴性和阳性对照,即样品对照和IgG的对照,并且取固定比例的超声液做input,一般取总超声液的1/50即可。

3.     1.5mL离心管中加入200ul超声液,400ulChIP Dilution Buffer Cocktail20ul磁珠(磁珠加入之前总磁珠充分混匀,边加还要边混,特别是对照实验,要保证磁珠加的一样多),5ug抗体(每种抗体浓度不一样,需要计算好),4慢摇过夜(用旋转仪最慢速旋转)。

4.     依次用低盐,高盐,LiclTE缓冲液500mL去洗磁珠,每次洗5min。(整个过程在冰上进行,第一次,用缓冲液洗之间应该换管子,每次洗都放到4℃去转)

 

四,    解交联

1.        ChiP elution buffer室温孵育让其中SDS完全溶解(最好每次都现配,时间不要放太久),在上述磁珠中加入100ul chipelution buffer1ul蛋白酶k20mg/mL),充分混匀,65 2h以上或者过夜。

TIPS:1, input一定跟着相同的加,然后一起解交联。2, 注意加上封口膜,防止高温时液体的蒸发和泄漏。3TE洗完之后,可以短暂低速离心,并充分吸走上清。

2  将管子放入磁力架中,将上清转移至另一EP管中.

五,    DNA纯化

六,    定量PCR 验证。


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