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SDS碱裂解法制备质粒DNA-小量制备

2016-08-03 463 收藏

实验原理

用碱和SDS处理可以从小量(1-2ml)细菌培养物种分离质粒DNA,所获得的质粒则可以用电泳或限制性核酸内切酶笑消化的方法鉴定;经聚乙二醇处理进一步纯化后,可以用做DNA测序反应的模板。

实验材料

  • 碱裂解液Ⅰ
  • 碱裂解液Ⅱ
  • 乙醇
  • 酚氯仿(1:1)
  • TE(pH8.0)
  • RNase A
  • LB
  • 实验仪器

  • 摇床
  • 离心机
  • 实验步骤

    1. 挑转化后的单菌落,接种到2ml含有适当抗生素的丰富培养基中(LB),于37度剧烈振摇下培养过夜。注意试管不能盖紧。

    2. 将1.5ml培养物倒入微量离心管,用微量离心机于4度12000转离心30s,将剩余的培养物置于4度。

    3. 离心结束,尽可能吸干培养液。(未完全除去培养液会影响到后面限制性内切酶的活性)

    4. 将细菌重悬于100ul预冷的碱裂解液I中,剧烈振荡。

    5. 加200ul新配置的碱裂解液Ⅱ于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,不要振荡,将离心管放置于冰上。

    6. 加150ul预冷的碱裂解液Ⅲ,盖紧管口,反复颠倒数次,使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物种分散均匀,置于冰上3-5min。

    7. 4度12000转离心5min,将上清转移到新的离心管中。

    8. 加等量体积的酚:氯仿,振荡混合有机相和水相,然后4度12000转离心2min,将上清转移到新的离心管中。

    9. 用两倍体积的乙醇于室温沉淀核酸,振荡混匀,于室温放置2min。

    10. 用微量离心机于4度12000转5min,收集沉淀的核酸。

    11. 小心吸去上清液,将离心管倒置于纸巾上,使所有的液体流出排干。

    12.加1ml 70%的乙醇于沉淀中并将盖紧的试管颠倒数次,4度12000转离心2min,回收DNA。

    13. 吸除上清液,将开口的试管置于室温使酒精挥发,直至没有液体。

    14. 用50ul含有DNA酶的RNA酶A(20ug/ml)的TE重新溶解核酸,温和振荡几秒钟,储存于-20度。

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