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SDS碱裂解法制备质粒DNA(中量制备)

2016-08-05 452 收藏

实验原理

用碱和SDS处理可以从中度规模(20-50ml)的细菌培养物中分离质粒DNA。

实验材料

  • 碱裂解液I
  • 碱裂解液II
  • 碱裂解液III
  • 乙醇
  • 异丙醇
  • 酚:氯仿(1:1 体积)
  • 实验仪器

  • 4度离心机
  • 实验步骤

    1. 挑取转化后的单菌落,接种到10ml含有适当抗生素的LB中,于37度剧烈振摇下培养过夜。

    2. 将培养物转移到一个15ml的试管中,于4度以2000g(4000r/min)离心10min后收集细菌。

    3. 用轻缓抽吸的方法,尽可能吸干培养液。

    4. 将细菌沉淀重悬于200ul冰冷的碱裂解液I中,剧烈震荡,将悬浮液转移到微量离心管中。

    5. 加400ul新配置的溶液II到每细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物,不要用涡旋振荡,将离心管放置于冰上

    6. 加300ul冰冷的碱裂解液III,盖紧管口,反复颠倒多次,使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,然后将离心管置于冰上3-5min

    7. 用微量离心机于4度以最大转速离心5min,转移600ul上清到一只洁净的离心管中。

    8. 加等体积的酚:氯仿,通过剧烈振荡混合有机相和水相,然后用微量离心机于4度以12000转离心2min,将上层水相转移到新的离心管中

    9. 在室温下加600ul异丙醇以从上清中沉淀核酸,剧烈振荡混合溶液,于室温下放置2min。

    10. 用微量离心机于室温度以最大转速离心5min,收集核酸沉淀。

    11. 小心吸去上清,将离心管倒置于纸巾上,使所有液体流干。

    12. 加1ml 70%的乙醇于沉淀中并将盖紧的试管颠倒数次,室温下12000转离心2min.

    13. 再次轻轻吸去上清,要十分小心,因为质粒沉淀粘贴不牢。

    14. 开口试管置于室温,让酒精挥发完毕。

    15. 用100ul含有去DNA酶的RNase A(胰RNA酶)(20ug/ml)的TE重新溶解质粒沉淀,存储于-20度。

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