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A Brief Protocol for Gene Targeting by Cas9 in Zeb

2016-08-12 1198 收藏

实验原理

实验材料

  • T7 mMESSAGE mMACHINE® Kit,Ambion
  • 实验仪器

  • PCR 仪
  • 水浴锅
  • -20℃冰箱
  • 实验步骤

    一、Cas9靶位点的选择  

    Cas9靶位点(靶点)包含20个碱基,其中5’端应为GG;紧邻靶点3’端的3个碱基构PAM区,要求序列为NGGN为任意碱基)(图1)。可在正义链或反义链上选择靶位点。可参考如下的Cas9靶位点预测网站:http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx  

    注意5’端选择GG并非Cas9靶点本身的要求,而是由于本实验所用的gRNAguide  RNA)体外转录载体采用了T7启动子。T7启动子要求转录起始位点的前两位为GG,并且第三位最好为GA;如果采用其他的启动子,可以随之更改。

    二、Cas9靶位点的确认

    1. 确认靶点在基因组中的唯一性:靶位点序列在Ensembl网站进行blast,确认是斑马鱼基因组中的单一位点。2PCR扩增靶点序列:从准备用于打靶的成鱼中PCR扩增靶点及附近的序列。在靶位点周围设计引物,使其距离靶位点两侧都大于100 bp,并且PCR扩增产物最好不要超过500 bp,且为单一条带。 3.检测酶切效率:如果计划采用酶切法检测靶点的突变情况,则需要对上述PCR产物进行酶切验证。要求尽量酶切完全,并且电泳后能明显与原条带区分开。 4.测序确认靶点序列:将PCR产物直接送去测序(不需要TA克隆)。如果实测序列跟靶点的预测序列有出入,原则上应根据实测结果设计gRNA序列;但是,如果实测序列不再符合靶点选择的原则(例如,PAM区不是NGG,或5’端不是GG),则应重新选择靶点;如果测序结果显示靶点序列为杂合子,则最好重新选择实验材料。 5.遴选实验材料:采用上述的PCR与测序策略筛选出足够量的靶点正确且为纯合的成鱼,后续针对该靶点的实验最好都用这一批成鱼进行。

    三、合成gRNA

    设计特定靶点gRNA引物,以pDR274 为模板,PCR扩增。以液体回收方式纯化PCR产物。

    四、制备Cas9 mRNAgRNA  1.制备Cas9 mRNA

    (1)制备Cas9 mRNA的体外转录模板:通过XbaI单酶切线性化pSP6-2sNLS-spCas9载体 Amp抗性)(37℃,4 h以上);取少量电泳确认线性化完全后,直接回收线性化产物。

    (2)体外转录Cas9mRNA  mRNA体外转录体系(SP6mMESSAGE mMACHINE® KitAmbion):

    (3)添加polyA序列、回收得到可用于显微注射的Cas9 mRNA(添加polyA序列可增强 mRNA的稳定性和翻译效率)。  mRNApolyA的反应体系:  (这里选用的是NEB的加A体系;也可以使用Ambion的加A试剂盒)

    2 制备gRNA  1)制备gRNAPCR体外转录模板:用T7-cr fwdtracr rev引物对,以构建好的gRNA体外转录载体(例如pT7-thgRNA质粒)为模板,使用高保真酶PCR,得到gRNA体外转录模板(58℃退火,延伸30 sec40 cycle40 μL体系)。取μL PCR产物电泳,确认为单一条带(125 bp)后直接回收PCR产物,用于后续的步骤。  T7-cr fwd序列:5-GAAATTAATACGACTCACTATA-3 tracr rev序列:5-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3 2)体外转录gRNA  gRNA体外转录体系: (这里选用的是AmbionMAXIscript® T7 Kit;也可以使用其它的体外转录体系,例如Promega的产品,但是不要用体外转录mRNA的体系。)3)回收gRNA:建议使用AmbionmirVana miRNA Isolation Kit进行回收。也可采用LiCl沉淀法,但效率较低。 mirVana miRNA Isolation Kit回收小片段RNA 


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