动物DNA提取实验

创建日期:2014-08-01 查看:221
实验原理
在浓氯化钠(1-2 mol/L)溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度很大,核糖核蛋白的溶解度很小,在稀氯化钠(0.14 mol/L)溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度很小,核糖核蛋白的溶解度很大。因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液,将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。   将抽提得的核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理,DNA或(RNA)即与蛋白质分开,可用氯仿―异戊醇将蛋白质沉淀除去,而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇,DNA即析出。   为了防止DNA或(RNA)酶解,提取时加入EDTA(乙二胺四乙酸)。
实验步骤
一、试剂配制
 
1.  5 mol/L NaCl 溶液:将292.3 g NaCl 溶于水,稀释至1 000 ml。
 
2.  0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na 溶液: 溶8.18g NaCL 及37.2g EDTA-Na 于蒸馏水,稀释至1 000 ml。
 
3.  25% SDS 溶液: 溶25 g 十二烷基硫酸钠于100 ml 45% 乙醇。
 
4.  0.015 mol/L  NaCl 0.0015 mol/L 柠檬酸三钠溶液: 氯化钠 0.828 g及柠檬酸三钠0.341 g 溶于蒸馏水,稀释至1 000 ml。
 
5.  氯仿-异戊醇混合液:氯仿:异戊醇=24:1(V/V)。
 
6.  1.5 mol/L NaCL-0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液:氯化钠 82.8 g 及柠檬酸三钠34.1 g溶于蒸馏水,稀释至1 000 ml。
 
7.  3 mol/L乙醇钠 0.001 mol/L EDTA-Na溶液: 称取乙酸钠 408 g,EDTA-Na 0.372g 溶于蒸馏水,稀释至1 000 ml。
 
8.  70%乙醇,80%乙醇,95%乙醇,无水乙醇。
 
9.  1 mol/L过氯酸溶液:将10 ml 过氯酸(70%)用蒸馏水稀释至110 ml。
 
二、 DNA的分离纯化
 
1.  将10头小白鼠迅速杀死,取出肝脏,用0.14 mol/L NaCl 0.15mol/l EDTA溶液洗去血浆,剪碎,加入50 ml 0.14mol/L NaCl -0.15 mol/L EDTA溶液,置匀浆器中研磨,待磨成糊状后,将糊状物离心10分钟(4 000 r/min),弃去上清液,沉淀用0.14 mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液洗二、三次,所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。
 
2.  向上述沉淀物加入0.14 mol/LNaCl-0.15mol/L EDTA溶液,使总体积为44 ml,然后滴加25% SDS溶液 3 ml,边加边搅拌,加毕,置60水浴保温10分钟(不停搅拌)溶液变的粘稠并略透明,取出冷至室温。此步操作是使核酸与蛋白质分离。
 
3.  加入5 mol/LNaCl 10 ml,使NaCl 最终浓度达到1 mol/L,搅拌10分钟,加入约一倍体积的氯仿―异戊醇混合溶液,振摇20分钟,离心10分钟(4 000 r/min)。去掉沉淀,上层清液徐徐加入1.5-2倍95%乙醇,DNA沉淀即析出,用玻棒慢慢搅动,则DNA丝状物即缠在玻棒上。
 
4.  将DNA粗品置于27 ml  0.015 mol/L  NaCl -0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液中,再加入3 ml 1.5 mol/L NaCl-0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液,搅匀,加入一倍体积氯仿―异戊醇混合液,振摇十分钟,离心(4 000 r/min,10分钟),倾出上层液体(沉淀弃去),加入1.5倍体积95%乙醇,DNA即沉淀析出。离心,弃去上清液,沉淀(粗DNA)按本操作步骤重复处理一次。
 
5.  将上步所得沉淀于27 ml  0.015 mol/L  NaCl-0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液中,然后以线状徐徐加入2倍95%乙醇,边加边搅,取出丝状DNA,依次用70%,80%,95%以及无水乙醇各洗一次,真空干燥。
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