质粒DNA的大量制备实验-层析法

用层析方法纯化质粒DNA主要利用质粒DNA与初始裂解物中其他分子的物理性质的差别。核酸带负电,因此可用离子交换层析的方法进行纯化。大分子的质粒DNA可以通过凝胶过滤层析方法去除小分子杂质而得到纯化。现在许多离子交换层析纯化系统已经市场化了。因为没有一种方案适合所有的层析方法,所以用厂家所推荐的方法制备粗裂解物和装柱就尤为重要。 1.  参考文献:Bimboim,1983; Holmes and Quigley,1981 ; Radloff et al,1967。

2.  撰稿人:J. S.Heilig,Karen L. Elbing,and Roger Brent。
一、粗制裂解物的制备

在制备初始裂解物时使细菌培养容量和细胞浓度与预计的DNA含量和所用柱子对 质粒DNA的结合力相适合是非常重要的。过载的柱子会使系统的性能降低。而且裂解 物黏度过高,需要进行强有力的混合,会导致细菌基因组DNA的剪切和随后的质粒 DNA的污染。

通过层析方法制备的质粒DNA最常见的污染物是高分子质量的RNA。这种污染 物通过往重悬的细胞沉淀里加人5 0 μg/ml的RNA酶A可降 低。试剂同Qiagen-tip柱及包括RNA酶的5 Prime—3 Prime柱一起提供。

当粗裂解物上样到柱上时,粗裂解物中的固体物质会大大阻碍或完全阻止柱子的流 动。固体物质的主要来源就是沉淀时的漂浮物。为了确保没有 漂浮物,可以将上清液用干酪包布过滤,并且在离心之前加氯仿抽提;也可以再次对上 清液进行离心。粗裂解物在去除蛋白质和细胞碎片后可以直接加至Qiagen-tip柱。另 外,Qia滤器(Qiafilter)不需离心就可快速过滤细菌裂解物,去除蛋白质、细胞碎片 甚至是小的SDS沉淀物。

二、柱容量

商用柱子有多种容量,这直接关系到培养液体积、质粒的拷贝数和细胞密度。低拷 贝数的质粒和噬菌粒常需要大量的培养以获得足够的DNA。高拷贝的质粒所需的培养 容量则相对小一些。而用像极限肉汤这种支持高浓度细胞生长的培养基时,培养容量也 相对小一些。Qiagen提供的方法以表格的方式列举了提取不同来源的质粒推荐使用的 培养体积。

柱子过载大量的裂解物会影响分离特性,导致产量和纯度下降。对于其他的大多数 商业柱子来说,标准的方法是要保持大约500 ml LB培养基培养细菌的质粒在适当的拷 贝数从而使柱子的质粒产量较高。

柱子过载质粒DNA并不会阻止对DNA的回收,但超出柱子容量的DNA初上柱 就从柱子流过而被丢失。提高产量的方法之一是收集初次上样时从柱子流出的液体。有 些柱子可通过质粒DNA的洗脱和初次流出液再上柱能够再生。只有某些柱子可以再 生;需按照制造商的方法进行操作。
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