DNA纯化实验-PCR清洁试剂盒纯化法

创建日期:2013-10-24 查看:221
实验原理
硅胶膜可在高盐条件下结合DNA,又可在低盐条件下与DNA分离。用于清洁目的的含DNA溶液中的引物、单核苷酸、酶、矿物油、盐离子等杂质因为没有与DNA相似的特性,所以被分离开来。
 
实验步骤
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
 
1.  说明书,耗材:96孔DNA制备板,96孔1.6 ml深孔板,96孔V型底板。
 
2.  Buffer PCR-A:DNA结合溶液。室温密闭贮存。若出现沉淀,应于65°C温浴溶解并冷却至室温后再使用。
 
3.  Buffer W2 concentrate:去盐液。使用前,根据瓶上指定的体积加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%无水乙醇。
 
4.  Eluent:2.5 mM Tris-HCl,pH 8.5。室温密闭贮存。
 
二、操作步骤
 
用户可以选择负压法或离心法。
 
A. 负压法
 
1A.  正确连接负压装置,将96孔DNA制备板置于负压装置上;在PCR、酶切、酶标或测序反应液中,加3个体积的Buffer PCR-A(若Buffer PCR-A不足100 μl,加至100 μl);混合均匀后转移到96孔DNA制备板中,开启并调节负压至-25-30英寸汞柱,缓慢吸掉板中溶液。
 
2A.  加0.3 ml Buffer W2,吸尽管中溶液。以同样的方法再用0.3 ml Buffer W2洗涤两次。
 
* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 
3A.  保持负压将96孔DNA制备板抽吸10 min。
 
4A.  导流管朝下将96孔DNA制备板于长纤维性纸巾上用力拍击6次。
 
5A.  将96孔DNA制备板置于96孔V型底板上,在膜正中央加25-30 μl水或Eluent,室温静置1 min。≥3 000×g离心5 min洗脱DNA。
 
B. 离心法
 
1B.  在PCR、酶切、酶标或测序反应液中,加3个体积的Buffer PCR-A(若Buffer PCR-A不足100 μl,加至100 μl);混匀后,转移到96孔DNA制备板中,将96孔DNA制备板置于96孔1.6 ml深孔板中,1 000×g离心1 min,弃滤液。
 
2B.  在96孔DNA制备板中,加0.3 ml Buffer W2,1 000×g离心1 min,弃滤液。以同样的方法再用0.3 ml Buffer W2洗涤一次。
 
* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 
3B.  将96孔DNA制备板置于96孔1.6ml深孔板中,≥3 000×g离心10 min。
 
4B.  将96孔DNA制备板置于洁净的96孔V型底板中,在膜正中央加25-30 μl水或Eluent,室温静置1 min。≥3 000×g离心5 min洗脱DNA。
注意事项
1.  将洗脱液或水加热至65°C,有利于提高洗脱效率。
 
2.  DNA分子呈酸性,建议在2.5 mM Tris-HCl,pH8.5洗脱液中保存。
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