蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

蛋白质在十二烷基硫酸钠(SDS)和巯基乙醇的作用下,分子中的二硫键还原,氢键等打开,形成按1.4 g SDS/1 g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物,该复合物带负电,故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移,且主要由于凝胶的分子筛作用,迁移速率与蛋白质的分子量大小有关,因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。   聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统,主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶,配制凝胶的缓冲液,其pH值和离子强度也相应不同,故电泳时,样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动,在分离胶表面形成了一个极薄的层面,大大浓缩了样品的体积,即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。
一、试剂
 
1.  30%凝胶贮备液:称取29 g 丙烯酰胺(Acr)和1 g 甲叉-双丙烯酰胺(Bis),加蒸馏水至100 ml,滤纸过滤贮存。
 
2.  10% SDS:称取SDS 10 g 加蒸馏水至100 ml。
 
3.  10%过硫酸胺(AP)
 
4.  N,N,N’,N’四甲基乙二胺(TEMED)
 
5.  5×电泳缓冲液:于900 ml蒸馏水中分别加入15.1 g Tris、94 g甘氨酸、5 g SDS,混匀后加蒸馏水至1 000 ml。
 
6.  1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0 mol/L Tris-HCl(pH6.8)
 
7.  电泳加样缓冲液
10 mmol/LpH6.8 Tris
200 mmol/LDTT
4%SDS
0.2% 溴酚兰
20% 甘油
 
8.  正丁醇
 
二、器材
 
移液器、移液管、烧杯、垂直电泳槽、电泳仪。
 
三、操作步骤
 
1.  配制分离胶浓度8%、体积15 ml
H2O :6.9 ml
30%凝胶贮备液 :4.0 ml
1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) :3.8 ml
10%SDS: 0.15 ml
10%过硫酸胺: 0.15 ml
TEMED: 0.01 ml
 
2.一旦加入TEMED,混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中,为成层胶留有足够空间。用毛细管轻轻在其顶层加入几毫升正丁醇,以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。
 
3.  聚合完成之后,倒掉覆盖液体,用去离子水洗凝胶上部数次,尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。
 
4.  配制5%成层胶5 ml,插入梳子,小心避免混入气泡,垂直放置室温下。
H2O :3.4 ml
30%凝胶贮备液: 0.83 ml
1.0 mol/Ltris-HCl(pH6.8) :0.63 ml
10%SDS :0.05 ml
10%过硫酸胺: 0.05 ml
TEMED :0.01 ml
 
5.  在成层胶聚合时,将样品与加样缓冲液混匀,100℃加热3 min。
 
6.  成层胶聚合完成后,用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺,将凝胶放入电泳槽上。
 
7.  加样。
 
8.  电泳:开始时电压为8 V/cm凝胶,染料进入分离胶后,将电压增加到15V/cm凝胶,继续电泳直到染料抵达分离胶底部,断开电源。
 
9.取下凝胶,固定、染色或进行分析。
科研狗©2015-2024 科研好助手,京ICP备20005780号-1 建议意见

服务热线

178 0020 3020

微信服务号