外源DNA片段在质粒载体中的克隆实验

限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段,经DNA的纯化处理后用于连接反应;选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割,并用碱性磷酸酶处理防止载体自连;在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上,实现外源片段的克隆。
1.  载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切:
50 μl反应体系,用1.5ml tube,冰上操作)
DNA           30 
μl
R.E           1 μl
10×buffer        5 μl
ddH2O           14 μl

外源片段酶切产物和5 μl 37 ℃反应1hr,分别取8 μl  PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全;按2-5步纯化、回收DNA

2.  加入ddH2O 150  (扩大体积),加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混匀,12000 g离心10 min;

3.  吸取上清,加1/10体积3 M NaAc和两倍体积无水乙醇,-20 ℃放置15分钟以上;

4.  12000 g 4 ℃冷冻离心15分钟;

5.  ddH2O(1.5 ml ddH2O(0.5 ml tube中),PUC18溶于20 
μl 倒去上清,用75%乙醇浸洗沉淀,风干后外源DNA溶于10  tube中);

6.  按以下反应去除载体PUC18的5’磷酸基团,50 ℃反应30 min 以上
DNA                   20 
μl
CIAP(TaKaRa)        0.5 μl
buffer              4.0 ´10 μl
ddH2O               15.5 μl

7.  70 ℃水浴10 min, 使CIAP失活;

8.  按2-5步纯化载体,溶于10 
μl ddH2O;

9.  连接反应
DNA                10 
μl
pUC18            2.5 μl
buffer           1.5 ´5 μl
mT4 ligase   3 U/μl

16 ℃水浴过夜

10.  转化大肠杆菌感受态细胞

11.  转化子的鉴定
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