细胞凋亡检测实验-DNA ladder法
发生细胞凋亡时，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNA ladder）。
一、材料与试剂准备
1. 材料：凋亡细胞。
2. 蛋白酶K（500 μg/ml）， 醋酸钾氯仿（8 mol/L），无水乙醇，70%乙醇，2%琼脂糖凝胶。
3. 白细胞裂解液：pH8.0，10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，1% SDS。
二、操作步骤
1. 收集凋亡细胞：取1～2×106 个细胞，离心后，立即用70%酒精（-20℃）固定2 h。
2. 洗涤：取出酒精固定的细胞，1 000 r/min离心5 min ，去掉上清液，PBS洗二次。
3. 裂解细胞：加400 μl细胞裂解液，充分混匀再加蛋白酶K 100 μl，置65℃水浴消化2小时或过夜。
4. 蛋白处理：加75 μl 8 mol/L的醋酸钾，4℃15 min，再加750 μl氯仿，充分混匀后，10 000 r/min离心10 min后，将上清移至一新的Eppendorf管中。
5. 沉淀DNA：加入750μl无水乙醇，上下轻柔颠倒混合，即可见乳白色沉淀，若不明显时可置-20℃过夜，12 000 r/min离心10 min，去上清。
6. 洗涤DNA：加1 ml 70%乙醇，混匀，10 000 r/min 离心5 min，去上清。
7. 溶解DNA：根据 DAN 沉淀的大小，加一定量的蒸馏水或TE，37℃溶解。
8. 测定DNA浓度。
9. 2%琼脂糖凝胶电泳80 V 2小时。
三、结果判断
出现梯状电泳条带，最小的条带为180～200 bp，其他的条带为其整倍数大小。坏死细胞则出现弥散的电泳条带，无清晰可见的条带。正常细胞DNA基因条带因分子量大，迁移距离短，故停留在加样孔附近。
