核酸纯度、浓度与分子量测定实验-紫外分光光度法

溴化乙锭是一种荧光染料,在凝胶电泳中,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间,在紫外线激发下发出荧光,其强度与DNA量成正比。同时核酸最大吸收波长在260nm,在此波长下,吸光度1 A相当于一定浓度的核酸,可以通过A260/A280 的比值,来测定所得核酸的纯度。
1.  将分光光度计打开,预热10分钟。

2.  将核酸溶液中取2 µl,加(或纯水)使体积成为100 µl。

3.  将稀释溶液加入石英管,以TE buffer(或纯水)为标准倒入另一管。

4.  在波长260、280 nm 处测定吸光值。

5.  比较在260 nm 及280 nm 之读值。
注意事项
1.  A260/A280>1.8表示DNA/RNA的纯度高。若数值<<1.8,表示纯度低,这时由OD260测得的DNA含量较不可信,核酸溶液中含有较多蛋白质,因此最好将前述所得核酸再重新抽取。

2.  测定260 nm吸光值,OD=1.0代表值如下:

(1)ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml

(2)ss DNA (single stranded DNA or simgle-stranded RNA) = 40 mg/ml
 
(3)oligonucleotide = 33 mg/ml
 
3.  EB是致癌物质,切勿用手接触,更不要污染环境。
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