质粒DNA大量制备实验-平衡离心法

这种方法可以得到除去了大多数杂质的高纯度质粒DNA。但它需要使用溴化乙锭,并且需要长时间的超速离心来形成密度梯度。
 
1.  粗裂解物制备方案最后一步得到的沉淀溶于4 ml TE缓冲液中,加入4.4 g CsCl,溶解后,再加入0.4 ml 10 mg/ml 溴化乙锭。
 
2.   将溶液转入一个5 ml 的quick-seal快速封口的超离心管中。

3.  酌情往管中加入CsCl/TE溶液,封好离心管。

4.  于20℃,500 000 g离心3.5 h或于20 ℃,以350 000 g 离心14 h 以上。
 
5.  首先从管的顶端描入一支针头,然后用带另一 20G针头的3 ml 注射器将质粒带吸出。
 
6.  进行第二次超速离心,除去混杂的RNA和染色体DNA以获得更高纯度的质粒。
 
7.  按质粒溶液的1.5~2倍体积装Dowex AG50W-X8柱子,用数倍体积的TE/0.2 ml NaCl溶液清洙和平衡柱子。

8.  用注射器将混合有溴化乙锭的质粒DNA溶液直接加到树脂的顶部,注意不要摇动树脂。
 
9.  立即收集流出液,然后用2倍于上样体积的TE/0.2 ml NaCl溶液洗脱柱子两次。
 
10.  加入2倍体积乙醇于室温或-20℃沉淀质粒DNA,于4℃,以10 000 g 离心 10 min。
 
11.  沉淀用70%乙醉洗涤1遍,真空干燥,溶解于TE缓冲液,并于4 ℃保存。
注意事项
一、溴化乙锭是一种诱变剂并能造成环境污染,操作时应戴手套,并且妥善处理。

二、为了防止紫外线对眼睛的严重拫伤,应戴紫外防护眼镜或面罩。
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