细菌中制备基因组DNA实验-小量制备
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
1. 培养5 ml 的细菌培养物至饱和状态,取1.5 ml 的培养物离心2 min。
2. 沉淀物加入567 μl 的TE缓冲液,用吸管反复吹打使之重悬。
3. 加入30 μl10%的SDS和3 ℃ 20mg/ml蛋白酶K,混匀,于37℃温育1 h。
4. 加入100 μl 5 mol/l NaCl充分混匀,再加入80 μlCTAB/NaCl溶液,混匀,于65℃温育10 min。
5. 加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,离心4~5 min将上清液转人一个新管中,如果难以移出上清,先用牙签除去界面物质。
6. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀,离心5 min,将上清液转入一只新管中。
7. 加入0.6体积异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,用一个封口的巴斯德管将沉淀转移至1 ml 的70%乙醇中洗涤。
8. 离心5 min,弃上清,用冻干机稍加干燥,重溶于的下100 μl TE缓冲液,每次酶切反应用10~15 μl。