液氮罐冻存细胞准备工作与步骤

tcydg 2022-05-17 15:18:49 阅读: 261

用液氮罐冻存细胞需要做哪些准备工作,有哪些操作步骤呢?

一、物品准备

超净工作台、酒精灯、废液缸、移液枪、培养瓶或培养皿、培养基、15ml离心管、0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、DMSO、胎牛血清、离心机、冻存管等。

二、步骤

1.配制含10%DMSO冻存培养液(DMSO:FBS=1:9或DMSO:FBS:培养基=1:2:7)。

2.取对数生长期细胞,去除旧培养液,用PBS清洗1-2次。

3.去除PBS,加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来。

4.将细胞悬液转移到15ml离心管中,并置于离心机中,800-1000rpm,室温离心5分钟。

5.去除细胞上清,加入适量配置好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀、计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5.0x106 /ml-1.0x107 /ml。

6.将细胞分装入冻存管中,每管1-1.5ml。

7.将冻存管上标明细胞名称及代数、冻存时间、操作姓名。

8.冻存:标准的冻存程序为降温速率4℃(30min)→ -20℃(1h)→ -80℃(过夜,至少8小时为宜)→ 液氮罐

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