质粒DNA提取实验-碱解法

创建日期:2013-08-28 查看:556
实验原理
质粒多为一些双链、环状的DNA分子,是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作,进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。
 
提取质粒的基本步骤分为三步:
①细菌的培养和质粒的扩增
②细菌菌体的裂解
③质粒DNA的纯化
实验步骤
一、材料与试剂准备
 
1.  材料:大肠杆菌。
 
2.  仪器:超净工作台,培养箱,摇床,恒温水浴锅,台式离心机,取液器一套,低温冰箱,冷冻真空干燥机,电泳仪,水平电泳槽,紫外观测仪。
 
3.  试剂:
 
(1)Solution I :25 mM Tris-Hcl(pH7.4),10 mM EDTA(pH8.0),50 mM葡萄糖,高压灭菌,4℃保存。
(2)Solution II :0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用。
(3)Solution III :5 N KAc pH4.8,高压灭菌,4℃保存。
(4)3 M NaAc pH5.2,高压灭菌,4℃保存。
(5)异丙醇,溶菌酶(8 mg/ml),酚/氯仿,无水乙醇,70%乙醇,LB培养基,电泳试剂。
 
二、操作步骤
 
1.  细菌繁殖:LB培养基,2 ml/20 ml,37℃,200 rpm,摇一摇,过夜。
 
2.  离心10 min,5 000 rpm, 4℃;弃上淸液。
 
3.  沉淀(菌体细胞)预冷的TES缓冲液洗涤,离心10 min,5 000 rpm, 4℃,加入预冷的1 ml Solution I,冰浴10 min。
 
4.  重新悬浮,加入150 ul溶菌酶母液,室温放置5 min。
 
5.  加入1.2 ml Solution II, 冰浴5 min。
 
6.  加入0.9 ml预冷乙酸钾,混匀,离心10 min,12 000 rpm,4℃。
 
7.  加入1.5 ml异丙醇,-20℃冰箱内放置15 min。
 
8.  离心10 min,12 000 rpm,4℃。
 
9.  取沉淀,悬于400 ul TE缓冲液中。
 
10.  加入40 ul,3 M NaAc。
 
11.  酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀。
 
12.  离心10 min,12 000 rpm,4℃。
 
13.  取沉淀,冷冻干燥,再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
 
14.  电泳检测提取DNA的质量。
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