质粒DNA的大量制备实验-氯化铯/溴化乙锭平衡离心法

这种方法可以得到除去了大多数杂质的高纯度质粒DNA。但它需要使用溴化乙锭，并且需要长时间的超速离心来形成密度梯度。

1. 粗裂解物制备方案最后一步得到的沉淀溶于4 ml TE缓冲液中，加人4.4 g CsCl，溶解后，再加人0.4 ml 10 mg/ml溴化乙锭。如果用的是上清（也就是来自于备选方案），按上清的体积依比例扩大CsCl和溴化乙锭。

2. 将溶液转人一个5 ml的quick-seal快速封口的超离心管中，往管中加人1 g/ml CsCl/TE溶液，封好离心管。

3. 于 20°C，500000 g 离心3.5 h 或于 20 °C，以 350000 g 离心14 h 以上。

4. 小心地取出管子，从管的顶端插入一支20-G针头，然后用带另一 20-G针头的3 ml注射器将质粒带吸出（针头插入质粒带下约1 cm）。

5. 为了得到更高纯度的质粒DNA，在新管中进行第二次超速离心，管顶加有含0.1 mg/ml溴化乙锭的CsCl/TE缓冲液。

6. 按质粒DNA/EB溶液的1.5~2 倍体积装Dower AG50W-X8 柱子，用数倍体积的TE/0.2 mol/L NaCl溶液清洗和平衡柱子。

7. 用注射器将混合有溴化乙锭的质粒DNA溶液直接加到树脂的顶部，注意不要摇动树脂。立即收集流出液。

8. 用2倍于上样质粒溶液体积的0.2 mol/L NaCl/TE溶液洗脱柱子两次，用同一管子收集流出液。

也可以用等体积TE饱和的正丁醇来除去溴化乙锭。充分涡旋振荡混匀，然后除去有机相，重复几次直至在紫外灯下看不见红色，然后加人3倍体积TE缓冲液来稀释氯化铯，在本方法中产生的含有溴化乙锭的有机废物应该妥善处理。

9. 加入2倍体积100%乙醇于室温或-20°C沉淀质粒DNA。于4°C，以10000 g离心10 min。沉淀DNA时温度不要低-20°C，以免氯化铯沉淀下来。

10. 沉淀用70%乙醇洗1遍，真空干燥，溶解于TE缓冲液，并于4°C保存。

注意事项

1. 溴化乙锭是一种诱变剂并能造成环境污染，操作时应戴手套，并且妥善处理。

2. 必须在温度不低于15°C下离心，这是为了防止对转子和离心机的损坏以及潜在的严重的人员伤害。

3. 为了防止紫外线对眼睛的严重损伤，应戴紫外防护眼镜或面罩。操作溴化乙锭时要戴手套。