DNA纯化实验-DNA凝胶回收试剂盒纯化法

创建日期:2013-10-10 查看:244
实验原理
本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中提取多至 8 μg DNA(70 bp-10 Kb),回收率为 60-85%。琼脂糖凝胶在温和的缓冲液(DE-A 溶液)中溶解,其中的保护剂能防止线状 DNA 在高温下降解,然后在 DE-B 溶液的作用下使 DNA 选择性结合到膜上。纯化的 DNA 纯度高,并保持片断完整性和高生物活性,可直接用于连接、体外转录、PCR 扩增、测序、微注射等分子生物学实验。
 
实验步骤
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
 
1.  说明书,耗材:DNA 制备管、2 ml 离心管、1.5 ml 离心管。
 
2.  Buffer DE-A:凝胶熔化剂,含 DNA 保护剂,防止 DNA 在高温下降解。室温密闭贮存。
 
3.  Buffer DE-B:结合液(促使大于 70 bp 的 DNA 片段选择性结合到 DNA 制备膜上)。室温密闭贮存。若出现沉淀,应于 70°C 温育溶解并冷却至室温后再使用。
 
4.  Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。
 
5.  Buffer W2 concentrate:去盐液,使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用
100%无水乙醇或 95%乙醇。
 
6.  Eluent:2.5 mM Tris-HCl,pH 8.5,室温密闭贮存。
 
二、实验准备
 
1.  第一次使用前,Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。
 
2.  准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。
 
3.  准备75°C水浴。
 
三、操作步骤
 
1.  在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录 1.5 ml  离心管重量),该重量作为一个凝胶体积(如 100 mg = 100 μl 体积)。
 
2.  加入 3 个凝胶体积的 Buffer DE-A,混合均匀后于 75°C 加热(低熔点琼脂糖凝胶于 40°C 加热),间断混合(每 2-3 min),直至凝胶块完全熔化(约 6-8 min)。
 
3.  加 0.5 个 Buffer DE-A  体积的 Buffer DE-B,混合均匀;当分离的 DNA 片段小于 400 bp 时,加入 1个凝胶体积的异丙醇。
 
步骤 4-6 可以选择负压法或离心法。
 
A.  负压法
 
4A.  正确连接负压装置,将 DNA 制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤 3 中的混合液,转移到制备管中,开启并调节负压至-20-30 英寸汞柱,缓慢吸走管中溶液。
 
5A.  加 0.5 ml Buffer W1,吸尽管中溶液。
 
6A.  加 0.7 ml Buffer W2,吸尽管中溶液。以同样的方法再用 0.7 ml Buffer W2 洗涤一次。
 
*  确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 
B.  离心法
 
4B.  吸取 3 中的混合液,转移到 DNA 制备管(置于 2 ml  离心管)中,12 000×g 离心 1 min。弃滤液。
 
5B. 将制备管置回离心管,加 0.5 ml Buffer W1,12 000×g 离心 30 s,弃滤液。
 
6B.  将制备管置回离心管,加 0.7 ml Buffer W2,12 000×g 离心 30 s,弃滤液。(可选步骤)以同样的方法再用 0.7 ml Buffer W2 洗涤一次 12,000×g 离心 1 min。
 
*  确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 
7.  将制备管置于 2 ml 离心管中,12 000×g 离心 1 min。
 
8.  将制备管置于洁净的 1.5 ml  离心管中,在 DNA 制备膜正中央加 25-30 μl  水或 Eluent,室温静置1 min。12 000×g 离心 1 min 洗脱 DNA。
注意事项
1.  在步骤 1 中,将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间(线型 DNA 长时间暴露在高温条件下易于水解),从而提高回收率。勿将含 DNA 的凝胶长时间地暴露在紫外灯下,减少紫外线对 DNA造成的损伤。
 
2.  在步骤 2 中凝胶必须完全熔化,否则将严重影响 DNA 回收率。
 
3.  将 Eluent 或水加热至 65°C,有利于提高洗脱效率。
 
4. DNA 分子呈酸性,建议在 2.5 mM Tris-HCl,pH 8.5 洗脱液中保存。
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