血基因组DNA提取实验-血基因组DNA 试剂盒提取法

创建日期:2013-01-16 查看:220
实验原理
本试剂盒采用特殊的细胞裂解和蛋白去除液(包括蛋白酶K 裂解)从抗凝全血中得到基因组DNA。适用于从冻全血、血浆、血清、骨髓、其他体液、淋巴细胞、培养细胞、病毒和线粒体中提取DNA。
实验步骤
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
 
1.  说明书,耗材:96孔深孔板(1.6 ml),96圆孔板,96孔DNA制备板,96圆孔硅胶片,BF-400膜。
 
2.  Proteinase K:冻干的蛋白酶K 可室温贮存6 个月,长时间保存请置于4℃;溶解后,在2-8℃可贮存2 个月,长时间保存请勿置于室温中。
 
3.  Buffer PK :蛋白酶K 溶解液,室温密闭贮存。
 
4.  Buffer BL :细胞裂解液,室温密闭贮存。
 
5.  Buffer W1B concentrate :洗涤液。使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
 
6.  Buffer W2 concentrate :去盐液。使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
 
7.  10×Buffer W2(12×96 试剂盒):用于配制Buffer W2 。
 
8.  Eluent B:7.5 mM Tris-HCl,pH 8.5,0.3 mM EDTA ,室温密闭贮存。
 
二、实验准备
 
1.  第一次使用时,在Buffer W2 concentrate 和Buffer W1B concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
 
2.  Buffer W2(12×96 试剂盒)配制:在提供的500 ml 空瓶中加入15 ml 10×Buffer W2,135 ml 去离子水和350 ml 乙醇,可用100%无水乙醇或95%乙醇。
 
3. 根据瓶上标签将蛋白酶K 溶解于Buffer PK 中,请勿旋涡振荡。
 
4. 准备70℃温浴。
 
5. 使用前检查Buffer BL 是否有沉淀析出,若出现沉淀,请于70℃温浴加热至沉淀完全溶解后再使用。
 
三、操作步骤
 
1.  向96 圆孔板的每孔中加入20 μl 蛋白酶K。
 
2.  加200 μl 抗凝全血到96 圆孔板中。
 
* 若全血样品体积少于200 μl,用PBS 补充到200 μl。
* 若样品为鸟类血,样品用量须低于10 μl。
* 若需得到RNA-free 的基因组DNA,在步骤3 加入Buffer BL 前加入DNase-free 的RNase A(20 mg/ ml) 。
 
3.  加200 μl Buffer BL ,注意不要打湿每孔的边缘,用96 圆孔硅胶片密封各孔。
 
4.  用力混合30 s。
 
5. 3000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机,当速度达到3000rpm后即停止。
 
6. 在培养箱或烘箱中70℃温浴至少10 min。
 
7.  3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机,当速度达到3 000rpm后即停止。
 
8. 取下96 圆孔硅胶片,每孔加入200 μl 乙醇(96-100%)。
 
9.  用96 圆孔硅胶片密封各孔,用力混匀混合15 s。3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到圆孔板内。启动离心机,当速度达到3 000 rpm 后即停止。
 
10.  将96 孔DNA 板放到一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板。取下圆孔板上的96 圆孔硅胶片,将每孔中的溶液转移至96 孔DNA 板 中,6 000 rpm 离心4 min。
 
11.  丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液,将96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入500 μl Buffer W1B,用一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板,6 000 rpm 离心4 min。
 
* 确认在Buffer W1B concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 
12.  丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液,将96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入850 μl Buffer W2,用另一新 的BF-400膜密封96孔DNA板,6 000 rpm 离心4 min。
 
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 
13.  弃滤液,将96孔DNA板放回到96孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入400 μl Buffer W2, 用另一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板,6 000 rpm 离心4 min。
 
14.  将96孔DNA板放在一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上,用BF-400膜密封96孔DNA板,6 000 rpm离心15 min。
 
15.  将96孔DNA板放在另一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入100-200 μl Eluent B 或去离子水,室温静置2 min,用另一新的BF-400膜密封96 孔DNA板,6 000 rpm 离心4min洗脱得到DNA。
 
注意事项
 1.  Buffer BL 和Buffer W1B 含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水和生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。
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