植物体内氧自由基含量的测定实验

在生物体中,氧作为电子传递的受体,得到单电子时,生成超氧阴离子自由基(O2-)。 利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O2-含量。O2-与羟胺反应生成NO2-,NO2-在对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用下,生成粉红色的偶氮染料(对-苯磺酸-偶氮-α-萘胺)。取生成物在530nm波长处测定吸光度(A)值,根据A530值可以算出样品中O2-含量。反应式如下:
一、材料仪器设备及试剂

1. 材料:花生、绿豆、大豆黄化幼苗的下胚轴及其他植物叶片。

2. 仪器设备:高速冷冻离心机,分光光度计,恒温水浴锅,研钵,试管,移液管,试管架,移液管架,洗耳球等。

3. 试剂配制:

50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH7.8)

1 mmol·L-1盐酸羟胺

17 mmol·L-1对氨基苯磺酸(以冰醋酸 :水 = 3 :1配制)

7 mmol·L-1 α-萘胺(以冰醋酸 :水 = 3 :1配制)

50nmol· ml-1NaNO2母液

二、实验步骤

1. 提取液制备

称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中,加入50mmol·L-1磷酸缓冲液(pH7.8)5 ml, 研磨成匀浆,在1000r/min,4℃下离心10min,取上清液再以15000r/min,4℃下离心20min,第二次上清液即为样品提取液。

2. 亚硝酸根标准曲线的制作

2.1系列浓度NaNO2溶液的配制

取50nmol· ml-1NaNO2母液,分别稀释成0、10、20、30、40和50、nmol· ml-1的标准稀释液。

2.2取7支试管,编0~6号,分别加10、15、20、30、40、50、nmol· ml-1NaNO2标准稀释液1 ml,0号管加蒸馏水1ml,然后各管再加50mmol·L-1磷酸缓冲液1 ml,17 mmol·L-1对氨基苯磺酸1 ml和7 mmol·L-1 α-萘胺1 ml,置于25℃显色20min后,以0号管作空白对照,在530nm波长处测定吸光度(A)值。

2.3 标准曲线绘制

以1~6号管亚硝酸根(NO2-)浓度为横坐标,吸光度值作纵坐标,绘制标准曲线。

3.  O2-含量测定

取4支试管,编0~3号,1~号管分别加入样品提取液0.5 ml(三个重复),0号管加蒸馏水0.5ml,然后各管加入50mmol·L-1磷酸缓冲液0.5 ml,1 mmol·L-1盐酸羟胺1 ml,混匀,置于25℃ 1 h后,各管再加入17mmol·L-1对氨基苯磺酸1 ml和7 mmol·L-1α-萘胺1 ml,混匀,置于25℃显色20min,以0号管为空白对照,在530nm波长处测定吸光度(A)值。

三、结果计算

根据所测得的A530值,从标准曲线上查得样品中NO2-浓度,按公式(1)即可计算出样品中NO2-浓度。然后依据羟胺与O2-的上述反应,从NO2-对O2-进行化学计量,按公式(2)计算,即将按公式(1)计算得到的NO2-浓度乘2,得O2-浓度。也可根据被测样品与羟胺反应的时间和样品中蛋白质含量,按公式(3)求得O2-的生产率。

注意事项
如果样品中含有大量叶绿素将干扰测定,可在样品液与羟胺温浴后,加入等体积乙醚提取叶绿素。
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