植物根尖压片实验

有丝分裂是植物细胞分裂,体细胞增殖的主要方式,在有丝分裂过程中,细胞核内染色体准确地复制,并有规律地,均匀地分配到两个子细胞中,使子细胞和母细胞具有同样数目和形态结构的染色体,保证了植物细胞的遗传性状的一致。各种生长旺盛的植物组织中,如根尖组织,茎尖组织,居间分生组织,愈伤组织等,细胞常进行着旺盛的有丝分裂。在细胞分裂的适当时期取材,通过对供试材料进行一定的处理,就可以在显微镜下观察染色体的变化特点和染色体的形态特征,并进行染色体计数。 由于在有丝分裂的中期染色体具有典型的形态特征,并易于计数,因此为了获得更多的中期染色体图像,可以采用药物处理或冰冻处理的方法,阻止纺锤体的形成,使细胞分裂停止在中期。同时通过处理还可使染色体缩短,易于分散,便于进行观察研究。另外,通过对细胞组织进行酸性水解或酶处理除去细胞之间的果胶层,并软化细胞壁,使细胞容易彼此散开,有利于压片和染色。
1.取材:可在室内培养根尖,也可以直接从田间挖取刚长出的幼嫩根尖。室内培养的方法是:

(1)圆葱和大蒜根尖:发根前先将圆葱以根部向上在光下晒两天,然后置于盛清水的小烧杯口上,使根茎部与水接触,或将圆葱半埋于湿沙内。在20~25℃光照条件下培养2~3天,待根长1~2cm时,选健壮根自尖端约1cm处剪下备预处理用。大蒜作材料可先将蒜瓣扒去皮,然后用细铁丝串起放在盛清水的培养皿内培养,其它要求同上。剪取根尖的时间以上午10时左右为好。

(2)玉米(或黑麦,小麦,蚕豆)根类:先将种子浸泡一天,待吸水膨胀后再转移到铺有几层滤纸(或吸水纸)的培养皿内,加水湿润,然后将种子均匀地摆放在滤纸上,盖上盖。放在18~20℃黑暗条件下培养,待根长到1~2cm时,选健壮根尖于上午10时左右取下备用。

田间从植株上直接取根的方法适用于大部分禾本科植物,例如在麦类作物生长季长出的大量不定根,比种子萌发的根更健壮,是观察有丝分裂的很好材料。

2.预处理:为了阻止纺锤体的活动,获得更多的中期分裂相,同时使染色体相对缩短,便于染色体分散和计数,可对根尖进行预处理。如果只是为了观察有丝分裂各期染色体动态,可以不进行预处理。

预处理的方法有冰冻预处理和药物预处理两种。

(1)冰冻预处理:将根尖浸泡在蒸馏水中,置于1~4℃冰箱内或盛有冰块的保温瓶中冰冻24小时。这种方法对染色体无破坏作用,染色体缩短均匀,效果良好,简便易行,各种作物都适用。

(2)药物预处理:常用的药物有0.05~0.2%秋水仙素溶液,饱和对二氯苯溶液,0.002mol/L 8-羟基喹啉等。预处理时,将根尖直接浸泡在药液中,在适宜的温度下处理一定的时间(表1)。这些药物都能使染色体缩短,但同时对染色体也有一定破坏作用。使用时应注意处理的时间,小麦,黑麦,大麦,圆葱和大蒜等处理4小时左右,棉花和水稻等处理2小时左右。处理的时间长短同温度有很大关系。

3.固定或前低渗:固定的目的是利用化学药品将生活细胞迅速杀死,并使构成染色体的核蛋白变性和沉淀,以保持染色体的固有形态和结构。固定液一般采用卡诺氏固定液,配配制方法为无水酒精:冰醋酸=3:1,也可用95% 乙醇代替无水乙醇。

操作时将预处理后的根尖用蒸馏水冲洗两次(约5分钟),然后转移到卡诺氏固定液中。在4~15℃条件下固定20~24小时,即可进行观察。如果需要长期保存,可先用70%酒精冲洗2次然后转入70%酒精中保存。

4.解离:解离的目的是使细胞壁之间中层的果胶物质以及部分细胞质分解,而使细胞易于分散。同时也可使细胞壁适度软化而易于压片。解离的方法主要有以下几种。

(1)将根尖用蒸馏水冲洗2次,然后放入已经在60℃水浴锅中预热的1mol/L盐酸中。在60℃恒温条件下处理10~15分钟,当根尖透明呈米黄色时取出。

(2)将根尖置于95%酒精和浓盐酸的等量混合液中处理2~10分钟。或将根尖放在5ol/L盐酸内处理5~10分钟。

(3)将根尖置于2.5%果胶酶和2.5%纤维素酶等量混合液中(PH 5~5.5),在室温18~28℃条件下处理2~3小时。

5.后低渗:将根尖放在蒸馏水中冲洗2~3次(约10分钟)。酶解后的根尖可浸泡10分钟,然后再冲洗一次。根尖一定要冲洗干净,否则影响染色。低渗后的根尖放入70%酒精中备用。

6.染色与压片:染色与压片的方法常用的有以下几种。

(1)醋酸洋红染色法:取一根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液,然后放在一张干净的载玻片中央。用刀片将根尖分生组织切下,将其切成薄片(越薄越好),滴1滴2% 醋酸洋红染色液,盖上盖玻片,进行压片。压片时用一手固定盖玻片,另一手用镊尖或解剖针柄轻敲盖玻片,使材料溃散。用火轻烤载玻片背面,然后继续轻敲,待材料呈云雾状即可镜检。加热的目的是使染色体充分染色和软化,以及破坏细胞质的染色。如发现有较理想的分裂相,可再轻烤一下片子,然后在盖玻片上盖一张吸水纸,用大拇指用力压片(不可使盖玻片移动),然后镜检。

也可以采用十字交叉压片法。即:取根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液,然后放在干净的载玻片中央。用刀片将分生组织切下,将其切成薄片。取另一张干净的载玻片,呈十字形交叉盖在放有材料的载玻片上。在载玻片上盖一张吸水纸,并用大拇指压片,使材料压成一薄层。然后将两载玻片分开,各滴加1滴染色液进行染色。稍停片刻后加上盖玻片,在酒精灯上轻烤一下片子,一手固定盖玻片,另一手用铅笔橡皮头对准材料轻轻敲打,使根尖细胞分散均匀。

(2)改良卡宝品红染色压片法:将根尖置于干净的载玻片中央,切下根尖分生组织,将其切成薄片,滴一滴改良卡宝品红染色液,盖上盖玻片压片。。

(3)铁矾苏木精染色压片法:先将根尖放入4%铁矾水溶液中媒染2~4小时。然后流水冲洗20分钟,再将根尖放入0.5%苏木精染液中避光染色40~120分钟,取出后放入蒸馏水中备用。其制片方法,取一染色后的根尖放在干净载玻片的中央。用刀片将根尖分生组织切下,将其切成薄片(越薄越好),滴1滴45%冰醋酸,加盖玻片,具体压片方法同上。

7.镜检:压好的片子先在低倍镜下镜检,找到分裂细胞后转换高倍镜观察。如果染色体分散较好,图象清晰,就可以脱水封片,制成永久片。
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