血基因组DNA提取实验-血基因组DNA中量试剂盒提取法

创建日期:2013-04-20 查看:208
实验原理
本试剂盒采用独特的两相分离技术,结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到纯化基因组DNA的目的。适合从3ml的抗凝人或哺乳动物全血获得100 μg的基因组DNA,抗凝鸟类或两栖动物全血中获得多至120 μg的基因组DNA。
实验步骤
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
 
说明书,耗材:中量制备管、中量滤器、连接管、塑料扳手、中量管盖。
 
Buffer VL:细胞和病毒裂解液,室温密闭贮存。
 
Buffer G-B:蛋白沉淀液,室温密闭贮存。
 
Buffer DV-A:Buffer DV 的制备液,请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制,室温密闭贮存。
 
Buffer DV:相分离液,室温密闭贮存。
 
Buffer BV:DNA 结合液,室温密闭贮存。
 
Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。
 
Buffer W2 concentrate:去盐液。使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
 
Eluent:2.5 mM Tris-HCl,pH 8.5,室温密闭贮存。
 
二、实验准备
 
1. 第一次使用时,在Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
 
2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip 头、离心管。
 
3. 制备Buffer DV:取2 ml Buffer DV-A 125 ml 异丙醇,75 ml 异丁醇,加入提供的250 ml 试剂瓶中,混合均匀。
 
4. 4℃预冷Buffer DV。
 
三、操作步骤
 
【DNA 释放 】
 
1. 将3 ml 抗凝全血加入一50 ml 离心管中,若全血样本体积不足3 ml,用PBS 补充至3 ml。

2. 加入6 ml Buffer VL,盖紧离心管帽,旋涡振荡1 min。
 
3. 加入6 ml Buffer G-B,再次盖紧离心管帽,立刻上下混匀。
 
【两相分离去除蛋白和其它杂质】
 
4. 加入12 ml Buffer DV(4℃预冷),用力混合均匀。≥5 000×g 离心5 min。
 
* 请在实验前按实验准备中提供的方法准备Buffer DV。
 
5. 尽可能吸尽蓝色上相,保留相间沉淀和下相。加入12 ml,4℃预冷Buffer DV,用力混合,≥5 000×g 离心5 min。
 
【基因组DNA 的纯化】
 
6. 丢弃上相,将下相转移至中量滤器中(滤器置于另一50 ml 离心管中),将活塞插入注射器,缓慢推动活塞,收集50 ml 离心管中的滤液。
 
* 上相必须完全弃尽。
* 如在转移过程中下相没有任何界面沉淀,步骤6 可以省略。
 
7. 弃滤器,在滤液中加入6 ml Buffer BV,混合均匀。
 
8. 将连结管插到负压装置的插口上,再将DNA 中量制备管插到连结管上。将步骤7 的混合液移到制备管中,开启并调节负压装置至-20-30 英寸汞柱,吸尽管中液体。
 
9. 保持负压,加入8 ml Buffer W1,吸尽管中液体。
 
10. 保持负压,加入9 ml 已加入乙醇的Buffer W2,吸尽管中液体。
 
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 
11. 用塑料扳手将中量制备管中的DNA 结合部分从负压装置转移至另一洁净的1.5 ml 离心管中,加入0.3 ml Buffer W2,盖上中量制备管盖后,12 000×g 离心2 min。
 
12. 将DNA 结合部分置于另一洁净的1.5 ml 离心管中,在silica 膜中央加0.5 ml Eluent 或去离子水,盖上中量制备管盖后,室温静置2 min,12 000×g 离心1 min 洗脱DNA。
 
* 将去离子水或Eluent 加热至65℃将提高洗脱效率。
 
13. 可选步骤:同样方法,在silica 膜中央加0.25 ml Eluent 或去离子水,盖上中量制备管盖后,室温静置1 min,12 000×g 离心1 min 洗脱DNA。
 
注意事项
1. Buffer VL,Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水和生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。

2. 在按照此说明书操作前,请确保已做好足够的对血传播病毒的防护工作,按照正确方法处理体液和感染源。
 
3. 操作时严格按操作步骤进行,废物必须放入含消毒液的废物缸,并高压灭菌。
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