质粒DNA提取实验-SDS碱裂解法(试剂盒提取)

创建日期:2015-03-25 查看:273
实验原理
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
 
简明原理:碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性,再将pH值调至中性使其复性,复性的为质粒DNA,而染色体DNA不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去。
实验步骤
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
 
耗材:DNA 制备管,2 ml 离心管,1.5 ml 离心管。
 
RNase A:50 mg/ml,室温保存。
 
Buffer S1:细菌悬浮液。加入RNase A 后,4°C 贮存。
 
Buffer S2: 细菌裂解液,室温密闭贮存。(若出现沉淀,应于37°C 温浴溶解并冷却至室温后再使用。)
 
Buffer S3:中和液,室温密闭贮存。
 
Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。
 
Buffer W2 concentrate:去盐液。使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
 
Eluent:2.5 mM Tris-HCl,pH 8.5,室温密闭贮存。
 
二、实验准备
 
1.  第一次使用前,RNase A全部加入Buffer S1 中,4°C贮存。
 
2.  准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。
 
3.  第一次使用前,Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。
 
三、操作步骤
 
1.  取1-4 ml 在LB 培养基中培养过夜的菌液(若使用丰富培养基,菌液体积应减半或更少),12 000×g 离心1 min,弃尽上清。
 
2.  用250 μl 已加入RNase A 的Buffer S1 悬浮细菌沉淀,悬浮需均匀,不应留有小的菌块。
 
3.  加入250 μl Buffer S2,温和并充分地上下翻转混合4-6 次均匀使菌体充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min。
 
4.  加入350 μl Buffer S3,温和并充分地上下翻转混合6-8 次,12 000×g 离心10 min。
 
步骤5~7 可以选择负压法或离心法纯化质粒DNA。
 
A.  负压法
5A.  将质粒DNA 制备管插到负压装置的接口上。吸取步骤4 中的离心上清并转移到制备管中,开启并调节负压至-20-30 英寸汞柱,缓慢吸走管中溶液。
 
6A.  加500 μl Buffer W1,吸尽管中溶液。
 
7A.  加700 μl Buffer W2,吸尽管中溶液;以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。
 
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 
B. 离心法
 
5B.  吸取步骤4 中的离心上清并转移到DNA 制备管(置于2 ml 离心管中),12 000×g 离心1 min。
 
6B.  将制备管置回离心管,加500 μl Buffer W1,12 000×g 离心1 min,弃滤液。
 
7B.  将制备管置回离心管,加700 μl Buffer W2,12 000×g 离心1 min, 弃滤液;以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。弃滤液。
 
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 
8.  将制备管置回2 ml 离心管中,12 000×g 离心1 min。
 
9.  将制备管移入新的1.5 ml 离心管中,在DNA 制备膜正中央加60-80 μl 水或Eluent,室温静置1 min。12 000×g 离心1 min。
注意事项
1.  Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水或生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。

2.  本试剂盒为AxyPrep 质粒DNA小量试剂盒,适合于从1-4 ml 细菌培养物中提取多至20 μg 高纯的质粒DNA。
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