农杆菌感受态细胞制备实验-氯化钙法

创建日期:2014-01-28 查看:436
实验原理
在基因工程操作中,感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中,0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变,此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。
实验步骤
一、实验仪器、材料和试剂
 
1.  仪器

超净工作台,恒温摇床,冷冻高速离心机,高压灭菌锅,冰箱,-70℃超低温冰柜,分光光度计,接种针,10ml试管,50ml离心管,1.5ml离心管,冰浴,微量进样器及吸头。
 
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌,灭菌条件:120℃,15分钟。
 
2.  材料

土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株
 
3.  试剂

(1)YEB液体培养基(1 L):酵母提取物1 g,牛肉膏5 g,蛋白胨5 g,蔗糖5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,pH7.0,高压灭菌。
 
(2)利福平(Rif)储液:50 mg/ml
 
(3)20 mM CaCl2,高压灭菌。
 
二、实验步骤
 
1.  挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3 ml的YEB液体培养基(含Rif 50 mg/l)中,28℃振荡培养过夜。
 
2.  取过夜培养菌液1 ml接种于50 ml YEB(Rif 50 mg/l)液体培养基中,28℃振荡培养至OD600为0.5。
 
3.  取2 ml菌液,13 000 rpm,离心30 sec,弃上清。
 
4、加入1000 μl 20 mM CaCl2,使农杆菌细胞充分悬浮,冰浴30 min。
 
5、13 000 rpm,离心30 sec,弃上清,置于冰上,加入500 μl预冷的20 mM CaCl2,充分悬浮细胞,冰浴中保存,24 hr内使用,或液氮中速冻1 min,置-70℃保存备用。
 
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