DNA测序-自动测序法

ABI  PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪),采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法),因此通过单引物PCR测序反应,生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物,使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列,从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
 
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物,包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一,避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集,分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器,使DNA测序缩短至2.5h,PCR片段大小分析和定量分析为10~40min。
 
由于该仪器具有DNA测序,PCR片段大小分析和定量分析等功能,因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,临床上可除进行常规DNA测序外,还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
 
一、准备工作

1.  BigDye测序反应试剂盒  主要试剂是BigDye Mix,内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP,AmpliTaq DNA polymerase FS,反应缓冲液等。
 
2.  pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板  0.2 g/L,试剂盒配套试剂。
 
3.  M13(-21)引物  TGTAAAACGACGGCCAGT,3.2 μmol/L,即3.2 pmol/μl,试剂盒配套试剂。
 
4.  DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1 μl为宜。本实验测定的质粒DNA,浓度为0.2 g/L,即200 ng/μl。
 
5.  引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物,配制成3.2 μmol/L,即3.2 pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物,如M13(-21)引物,T7引物等。
 
6.  灭菌去离子水或三蒸水。
 
7.  0.2 ml或和0.5 ml的PCR管  盖体分离,PE公司产品。
 
8.  3 mol/L 醋酸钠(pH5.2)  称取40.8 g NaAc·3H2O溶于70 ml蒸馏水中,冰醋酸调pH至5.2,定容至100 ml,高压灭菌后分装。
 
9.  70%乙醇和无水乙醇。
 
10.  NaAc/乙醇混合液  取37.5 ml无水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混匀,室温可保存1年。
 
11.  POP 6测序胶  ABI产品。
 
12.  模板抑制试剂(TSR)  ABI产品。
 
13.  10×电泳缓冲液  ABI产品。
 
14.  ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。
 
15.  2400型或9600型PCR仪。
 
16.  台式冷冻高速离心机。
 
17.  台式高速离心机或袖珍离心机。

二、PCR测序反应
 
1.  取0.2 ml的PCR管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:
所加试剂                                 测定模板管          标准对照管
BigDye Mix                                   1 μl                  1 μl
待测的质粒DNA                           1 μl                   -
pGEM-3Zf (+) 双链DNA               -                   1 μl
待测DNA的正向引物                   1 μl                   -
M13(-21)引物                                 -                  1 μl
灭菌去离子水                                2 μl                 2 μl
总反应体积5 μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧PCR管,用手指弹管混匀,稍离心。
 
2.   将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2 min后进行PCR循环,PCR循环参数为96℃ 10 s,50℃ 5 s,60℃4 min,25个循环,扩增结束后设置4℃保温。
 
三、醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
 
1.   将混合物离心,将扩增产物转移到1.5 ml EP管中。
 
2.  加入25 μl醋酸钠/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃离心30 min,小心弃上清。
 
3.   加70%(V/V)的乙醇50 μl洗涤沉淀2次。12 000 r/min于4℃离心5 min,小心弃上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀10~15 min。
 
四、电泳前测序PCR产物的处理
 
1.  加入12 μl的TSR于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解DNA沉淀,稍离心。
 
2.   将溶液转移至盖体分离的0.2 ml PCR管中,稍离心。
 
3.  在PCR仪上进行热变性(95℃ 2 min),冰中骤冷,待上机。
 
五、上机操作  

1.  按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。

2.  仪器将自动灌胶至毛细管,1.2 kV预电泳5 min,按编程次序自动进样,再预电泳(1.2 kV,20 min),在7.5 kV下电泳2 h。

3.  电泳结束后仪器会自动清洗,灌胶,进下一样品,预电泳和电泳。

4.  每一个样品电泳总时间为2.5 h。

5.  电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
 
六、序列分析

仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知,可通过序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。
 
七、仪器清洗

测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
 
八、计算
 
1.  测序反应精确度计算公式:100%-差异碱基数(不包括N数)/650×100%。
 
2.  差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基,N为仪器不能辨读的碱基。
注意事项
1.  ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器,需专人操作、管理和维护。
 
2.  本实验测序PCR反应的总体积是5 μl,而且未加矿物油覆盖,所以PCR管盖的密封性很重要,除加完试剂后盖紧PCR管盖外,最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4~4.5 μl,则此PCR反应可能失败,不必进行纯化和上样。
 
3.  作为测序用户来说,只需提供纯化好的DNA样品和引物,一个测序PCR反应使用的模板不同,需要的DNA量也就不同,PCR测序所需模板的量较少,一般PCR产物需30~90 ng,单链DNA需50~100 ng,双链DNA需200~500 ng,DNA的纯度一般是A260 nm/A280 nm为1.6~2.0,最好用去离子水或三蒸水溶解DNA,不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2 pmol/μl较好。
 
4.  本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒,一般可测DNA长度为650 bp左右。本仪器DNA测序精确度为(98.5±0.5) %,仪器不能辨读的碱基N<2%,所需测定的长度超过了650 bp,则需设计另外的引物。为保证测序更为准确,可设计反向引物对同一模板进行测序,相互印证。对于N碱基可进行人工核对,有时可以辨读出来。为提高测序的精确度,根据星号提示位置,可人工分析该处彩色图谱,对该处碱基作进一步核对。
 
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