引物延伸实验

1.  依次加入下列试剂,建立用以标记引物的反应混合液(终体积10 μl)

(1)2.5 μl  H2O

(2)1 μl  10×T4多核苷酸激酶缓冲液

(3)1 μl  0.1 mol/l DTT

(4)1 μl  1 mol/l 亚精胺

(5)1 μl  50~100 ng/μl 挂核苷酸引物

(6)3 μl  10 μCi/μl[γ-32P]ATP

(7)0.5 μl  20~30 U/μl T4多核苷酸激酶

(8)37℃温育1 h。

2.  加入2 μl 0.5 mol/l EDTA和50 μl TE缓冲液终止反应,于65℃温育5 min。

3.  用硅化过的1 000 μl 吸头塞上玻璃棉作成一小离子交换拄,加入20 μl AG 50W-X8树脂和100 μl DE-52树脂,以1 ml TEN缓冲液洗柱。

4.  将步骤2的标记反应物加入柱子,收集流出液重复上柱。
 
5.  用1 ml,TEN100缓冲液洗柱,然后以0.5 ml TEN300洗,弃洗脱液。
 
6.  以0.4 ml TEN600缓冲液洗脱标记寡核苷酸引物,收集流出液,在有合适屏蔽的容器中保存于-20℃备用。

7.  取RNA样品在微量离心管中将下列物质混合(终体积15 μl):

(1)10 μl  细胞总RNA

(2)1.5 μl 10×杂交液

(3)3.5 μl  放射性标记寡核苷酸

(4)确保微量离心管密封,并将其淹没在65 ℃水洛中90 min,取出在空温中慢慢冷却。

8.  在冰浴的微量离心管中加入以下延伸反应混合液(终体积每个RNA样品30.33 μl):

(1)0.9 μl  1mol/l Tris·Cl缓冲液,pH8.3

(2)0.9 μl  0.5 mol/l MgCl2

(3)0.25 μl  1 mol/l DTT

(4)6.75 μl  1 mg/ml 放线菌素D

(5)1.33 μl  5 mmol/l 4dNTP混合液

(6)20 μl  H2O

(7)0.2 μl  25 U/μl AMV反转录酶
 
9.  在含有RNA及寡核苷酸的微量离心管中,加入30 μl 上述延伸反应混合物,42℃温育1 h。
 
10.  在毎个微量离心管中加入105 μl RNA酶反应混合物,于37 ℃育15 min。

11.  加入15 μl 3 mol/l 乙酸钠和150 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提,将上层水相移入一个干净管子中,再加入300 μl 乙醇沉淀DNA,沉淀物以100 μl 70%乙醇洗涤,用吸管吸去微量的乙醇残余,沉淀晾干5~10 min。

12.  用5 μl 终止/加样染料液重溶沉淀,65℃水浴加热5 min,在9%丙烯酰胺/7 mol/l 尿素凝胶中电泳至溴酚蓝到达凝胶的底部。

13.  干燥凝胶并用增感屏放射自显影。
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