大肠杆菌转化实验-热击法

创建日期:2014-08-24 查看:412
实验原理
质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面,经过42°C短时间的热击处理,促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。
实验步骤
一、实验材料准备

1.  器材
 
旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5 ml 微量离心管,双面微量离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LB-Amp),超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱。
 
2.  试剂
 
培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),无菌ddH2O,IPTG,X-gal。
 
3.  材料处理

无菌ddH2O,1.5 ml 离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。
 
二、操作步骤
 
1.  事先将恒温水浴的温度调到42℃。
 
2.  从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100 μl)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10 min。
 
3.   加入5 μl 连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100 ng),轻轻震荡后放置冰上20 min。
 
4.  轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2 min进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3~5 min。
 
5.  在超净工作台中向上述各管中分别加入500 μl LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。
 
6.  在超净工作台中取上述转化混合液100-300 μl,分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
 
7.  如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal,8 μl 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
 
8.  在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
 
9.  在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。
 
10.  观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。
注意事项
1.  玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂。
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