大肠杆菌转化实验-CaCl2转化法

创建日期:2015-01-15 查看:250
实验原理
实验步骤
1.  接种—个单菌落于50 ml LB培养液中,于37℃摇床培养过夜(250 r/min)。

2.  往一个2 L 的烧瓶中加入400 ml LB培养液,再加入4  ml 过夜培养液,于37℃;摇床,培养至OD590为0.375。

3.  将培养液分装到8个50 ml 预冷无菌的聚丙烯管中,于冰上放置5~10 min,然后于4℃,1 600 g 离心7 min。
 
4.  细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2“溶液重悬,于4℃,以1 100 g 离心5 min 。

5.  细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重悬,冰上放置30 min,于4℃,1 100 g 离心5 min。
 
6.  用2 ml  冰冷的CaCl2溶液重悬各管细胞,然后按每管250 μl 的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中,立即冻存于- 70℃。

7.  按照以下各步骤用10 ng pBR322转化100 μl 感受态细菌。

8.  将合适体积的转化物涂于含有氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养过夜。

9.  将10 ng 加入到一个15 ml 无菌的圆底试管中,并放置冰上。

10.  将盛有感受态细胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。

11.  立即将100 μl 感受态细菌加 入到管中,轻轻旋动,并放置冰上10 min 。

12.  将管故入42℃水浴2 min 进行热休克,然后加入1 ml LB 培养液于每一支试管中。

13.  于37℃置滚筒式摇床口培养1 h。

14.  将几个稀释度菌液涂布于含合适抗生素的平板上,于37℃培养12~16 h。
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