大肠杆菌转化实验-高效率电转化法

创建日期:2015-03-01 查看:271
实验原理
实验步骤
1.  接种一个单菌落于5 ml LB培养液,37℃温和振摇培养5 h 或过夜。

2.   将2.5 ml 培养物加人到盛有500 ml LB培养液的2 L 烧瓶中,37℃摇匀振荡培养至OD600为0.5~0.6。
 
3.  细菌在冰水浴冷却10~15 min,然后转移到预冷的1升离心瓶中。于2℃,5 000 g 离心20 min 沉淀用5 ml 预冷的水溶解6。

4.  加入500 ml 冰冷的水,混匀,按步骤3重复离心1次,立即将上清倒掉,用残余的液体重悬细胞。
 
5.  新鲜制得的细菌

(1)将悬浮液加入到预冷的50 ml 聚丙烯管中,2℃,5 000 g 离心10 min。

(2)估计细胞沉淀的体积,沉淀用等体积的冰冷水重悬。

(3)按50~300 μl 分装于预冷的微量离心管中。

6.  冻存细菌

(1)加入40 ml 冰冷的10%甘油,混合,然后按照步骤5离心。

(2)估计沉淀的体积,然后加入等体积的冰冷的10%甘油,重悬菌体。

(3)按50~300 μl 分装于预冷的微量离心管中。

(4)于干冰上冷冻并贮存于-80℃。

7.  将电转化仪调到2.5 kV、 25 μF ,脉冲控制器调到200~400Ω。

8.  将1 μl 质粒DNA加入到盛有新鲜制备的细菌或融化的冻存细菌的小管中,混匀。
 
9.  将转化混合物转移到预冷的电转化池中,吸干池的外表面,然后放入样品槽中。
 
10.  进行脉冲电转化,然后取出电转化池,马上加入1 ml SOC培养液,并且用巴斯德吸管转移到无菌的培养管中。

11.  于37℃,中速振荡培养30~60 min。

12.  分小份涂布于含有抗生素的LB平板上。
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