非程序DNA合成检测实验

非程序DNA合成(Unscheduled DNA Synthesis:UDS)即S期外的DNA合成。 在一般情况下细胞内DNA合成只见于S期,但当处于非S期细胞DNA受损伤时,随着DNA损伤的修复也将发生DNA合成现象,即UDS。 在化学致突变物、致癌物作用诱发细胞DNA损伤时,也诱导DNA出现UDS现象。 因此,UDS是检测环境致突变物、致癌物的短期测试方法之一。 如被检物具有致突或致癌性,当把同位素标记的DNA前体物加入培养环境中,受损DNA仍能在DNA 合成期外,以半保留复制的方式把DNA前体掺入到DNA链中,遂可应用同位素技术检测出来。 一、UDS实验需用适宜细胞,能表达UDS指示的理想细胞应该具有

1.  修复DNA 损伤能力;

2.  能代谢活化致癌物;

3.  间期细胞比例大,以及取材方便等
性质。

但是,并非每种细胞都具备上述要求条件。

实际上随细胞的不同各有利弊。常用
以下几类细胞

1.  原代培养大鼠肝细胞

具有代谢活化致癌物及修复DNA损伤能力,但S期细胞比
例大,适合用放射自显影法显示UDS,不宜作液闪计数。

2.  人外周血淋巴细胞

处于静止期细胞多为显示UDS的有利条件,但做致癌物筛
选时,存在个体之间的差异问题。

3.  人二倍体成纤维细胞

可用WI-38(ATCCCCL N075),能快速大量增殖,在细胞汇
合成单层后,发生接触抑制、细胞停止生长、DNA合成停止;用放射自显影或液闪计数 都能获满意的UDS效果,是比较理想的细胞,不足的是不能代谢活化致癌物。

二、结果评价
 
UDS反映致癌物对细胞的损伤和DNA修复,可用于检测和筛选环境致癌物,有人检 测化学物的致癌性,结果证明灵敏度为68%,附合性为69.1%。因此UDS是快速、敏感 筛选环境诱变和致癌物方法之一。UDS水平即DNA 修复性计算是以每次实验105细胞中 实验组和各对照组掺入3H-TdR dpm 之比。
以人二倍体成纤维细胞W1 38 为例

一、实验组合
 
为证实被检物作用的确切性,应做如下实验组合安排


二、放射自显影法UDS 的测定
 
1.  细胞培养

WI-38 成纤维细胞,完全培养液支持物盖片培养法培养,细胞生长至
汇合时;

2.  抑制DNA 合成

弃旧培养液,加入不含精氨酸的EMEM培养液,继续培养20~24 
小时;

3.  加测试物

加入10 mM羟基脲(阳性对照加MNNG),培养2 小时;

4.  H-TdR处理

2、3、4 每皿内加3H-TdR(5 μC/每皿)后,培养20~24 小时;

5.  漂洗

去除培养液,用不含钙、镁BSS漂洗;

6.  制片

制备放射自显影标本方法(参考原位杂交基因定位法)固定细胞、涂胶、
曝光、显影及染色;

7.  观察

在油镜下计数,首先要排除S期半保留复制细胞(为银粒密集覆盖的细胞
核),只计数核上的银粒数目,再扣除本底(每例计数30~50 个细胞),结果以 银粒数/核的均值或含10 个银粒左右细胞的百分率表示。

三、液闪计数法

1.  细胞培养和处理

人二倍体成纤维细胞:接种在培养皿中培养;

2.  加培养液、MNNG、羟基脲,以及3H-TdR处理等与前5项相同,自5漂洗后;

3.  消化

用0.25 %胰蛋白酶消化、制成悬液;

4.  液闪计数标本制备

10 %三氯醋酸处理,将细胞收集在玻璃纤维滤纸片上,无水
乙醇脱水烤干、置液闪杯中、加闪烁液、置液闪计数仪上计数;结果以dpm/106 细胞或cpm/每皿细胞表示。
注意事项
一、影响UDS的因素

1.  本底

与S期DNA合成不同,UDS的量很低,必须将本底控制在相当水平,才能显示UDS。 控制本底的关键是减少S期DNA合成;用缺精氨酸的Eagle液培养及羟基脲处理可达到 此目的。

做上述处理后也仍有一定量的本底,其来源包括

(1)少数S期细胞的半保留复制;

(2)轻度的微生物污染;

(3)胞浆线粒体的DNA 合成;

(4)自然修复;

(5)3H-TdR非特异性附着;

 
(6)放射化学杂质;

(7)胸腺嘧啶催化物的重新利用。

 
为控制本底,除减少或消除上述因素的影响外,值得注意的是,羟基脲用量过大时 也会抑制UDS,并有干扰待检物的作用。因此,应根据不同细胞选择羟基脲的浓度和作 用时间,至少使已知阳性致癌物作用能在羟基脲抑制本底水严时显示出来。

2.  药物特性

不同致突变物对细胞作用方式不同,诱导DNA损伤的类型也不用。因此,不同药物 的用量及作用时间也不一样。

例如,氮芥在10-4M 时,作用淋巴细胞2 小时就能诱发明
显的修复合成,而MNNG引起UDS的高峰却是在作用后的12 小时。

检测不同药物,尤其
环境致癌物时,应先作剂量反应曲线,选出最佳显示UDS时间,还要考虑代谢活化作用, 避免出现假阴性结果。

3.  细胞

当检测实验细胞的DNA 修复能力。用紫外线照射50 个细胞,结果以银粒数/核的均 值或含10 个银粒左右细胞的百分率表示。用二倍体细胞进行实验时,应先做核型分析。
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