火箭免疫电泳法是单向免疫扩散法的一种改进，通过应用直流电（稳压稳流）使抗（APOA1和B）在含有特异性抗体的琼脂糖凝胶中扩散，PH8.6时抗原向阳极移动，在泳动图中与凝胶中的抗体反应，逐渐形成类似火箭的沉淀锋，其锋高（或锋面积）与抗原浓度成正比，故可作抗原定量。

一、 实验器材：

l. 电压用稳压整流器，有流水冷却装置的电泳槽（国产电泳仪一般都可使

用）

2. 水平台。

3. 10cmX7cm玻璃板及同样大小的聚脂薄膜（选择不被染色的投影仪用薄

膜即可）．

4. 搭桥用纱布及滤条。

5. 粗滤纸若干张。

6. 琼脂糖胶打孔器。

二、实验试剂：

1. 巴比妥缓冲液，离于强度0.05 PH8.6

2. 10g/l琼脂糖（标准电内溶）用巴比妥缓冲液配制，加热溶化，沉淀后，分装10ml/管，冷却后4℃贮存。

3. 0.15mmol/lNaCl溶液。

4. 免（或羊）抗人apoA抗血清（效价不低于1：16）及apob抗血清（效价

不低于1：32）。

5. 定值参考血清．

6. 染色染：考马斯亮蓝R-250，0.259g溶于甲醇45ml中，加冰醋酸10ml及45ml混合，溶后备用。

7. 脱色液：每升含冰醋酸50ml及甘油100ml。

四. 实验操作：

l. 浇板：每板用1g/dl琼脂糖10ml，沸水浴中融化，混匀，冷至50－55℃

时加人apoA抗血清50ul，的apoB抗血清8ul（用量视抗血清效价而定），迅速混

匀后再预置在水平台上的玻璃板上冷却后放在4℃，20min后打孔，孔在板的阴

极端，孔径3mm，孔间距至少5mm，孔容量5ul，把板放在电泳槽，用滤纸搭桥。

2. 稀释抗原：用0.15mmol/lNacl液将定值参考血清稀释成1：100. 1：150. 1:200. 1：300及1：400（作标准曲线之用），血清标本按1：20O稀释，放4℃冰箱不超过3天。

3. 加样：在低电流状态（10mA/板）将稀释好的定值血清及样本分别吸取5ul（准确），加人琼脂糖凝胶加样孔内，每板都要做一系列标准。

4. 通电：稳电稳流24mA/板，端电压6-8V/cm，以流水冷却使琼脂保温15C电泳3－4h。

5.脱杂蛋白及了胶膜：电泳后的琼脂糖板浸泡在0．15mmol/lNaCL中3Omin，将胶膜抗置于聚脂膜上，用多层滤纸在轻轻加压吸干腔内水分，完后将滤纸. 胶膜与聚脂膜在者仪器自然干燥，或用热吹风机吹干，干后胶膜会自然与滤纸及聚脂膜分开。

6. 涂色：将琼脂糖胶膜平铺浸泡于染色液内20-30min。

7．脱色：用脱色液浸泡以染色的胶膜至火箭样清晰，背景基本无色，可在水

中用两张玻璃在将胶膜夹住，晾干后可长期保存，也可以用流水浸泡脱色至背景

干净。

三、计算：测量5种浓度的血清与每个标本的锋高（从孔中心到锋尖计），apoA1峰高于apoB峰，两者分别接抗原浓度与锋高作标准（或直线，但在轴上有截距）在曲线上查出每个标本中的apoA1与apoB浓度。

本法测定范围是：apoA1 0.4-2.5g/l  apoB 0.3-2.0g/l l. 抗原片稀释倍数与抗血清用量的计算，应以火箭峰清晰标准曲线斜率适中并成直线为宜，本法同时测定apoA1与apoB，应调整两种抗血清的量，使二者锋高有区别apoB锋不小于1cm。

2. 不同种类来源的血清（如兔与羊）在等效价的情况下进行试验，结果会有差异，apoA1测定以兔抗血清为好，用兔血清时锋逐形尖细，而羊血清所产生的峰粗l，锋尖圆钝，优势在峰项出现虚影。

3. 在一定条件下电泳不同的稀释度，参考血清的锋高不会有明显变动，标准曲线斜率基本一致，如标本峰高超出标本曲线范围时，应调整标本稀释倍数后测板间CV通常小于5%。

4. 火箭电泳结果可用染色法或直接肉眼观察可见的火箭峰．前者用样本mmol/少抗血清，但如适当增加标本及抗血清用量．不着色更为方便。

5“火箭峰的测量可以计算面积或峰高，面积是峰高乘以峰宽（峰半高处的宽度）测量精度最好能达0.1mm， 需用机械或电子放大设备。