枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备实验-化学改进法

用GM I和GM II溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a,用改进的方法制备感受态细胞。
 
一、实验材料准备

1.  枯草芽孢杆菌感受态制备用贮存液
 
(1)10×Spizizen salts母液: 15% K2HPO4·3H2O,6% KH2PO4,2% (NH4 ) 2 SO4,0.2% MgSO4,1% 柠檬酸钠,溶于蒸馏水中,6.6 ×104 Pa高压灭菌,室温贮存。

 
(2)10% 酵母粉、1% 水解酪蛋白和25 mmo l /L MgCl2, 6.6 ×104 Pa高压灭菌, 酵母粉溶液最好现用现配,水解酪蛋白和
MgCl2溶液可室温贮存;20%葡萄糖、0.25% 所需氨基酸和0.1 mo l/L CaCl2,用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌,葡萄糖溶液和CaCl2
溶液室温贮存, 氨基酸溶液- 20℃ 贮存。
 
2.   枯草芽孢杆菌感受态制备用培养基
 
(1)GM I:1mL 10 ×Spizizen salts, 0.1 mL,10% 酵母粉,0.25 mL 20% 葡萄糖,0.2 mL 1% 水解酪蛋白,0.2 mL 0.25%所需氨基酸,补充灭菌蒸馏水至总体积10 mL。

 
 (2)GM II:1 mL 10×Spizizen salts,0.05 mL10%酵母粉, 0.25 mL 20% 葡萄糖,0.04 mL 1% 水解酪蛋白,0.2 mL 0.25%所需氨基酸, 0.05 mL 0.1mo l/L CaCl2, 1 mL 25 mmo l/L MgCl2, 补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。

二、实验步骤

1.  挑取一新鲜培养的野生型枯草芽孢杆菌菌株BS501a菌落接种于2.5 mL GMI培养基中,30℃,130-150 r/min振荡培养过夜。

2.  将过夜培养物按10%接种量接种于2.5 mL新鲜的GM I中,37℃,200- 230 r/min振荡培养3.5h。

3.  再将培养物进行第二次传代, 接种于5 mL GMII培养基中,野生型菌株BS501a按5% 接种量进行第二次传代,37℃,200-230 r/min振荡培养90 min。

4.  取1mL培养物,5 000 r/min室温离心5 min,用1 /10体积上清液重新悬浮细菌沉淀,即为枯草芽孢杆菌感受态细胞。
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