PCR技术

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步,经过一定的循环,介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。
1.  调整模板浓度至10 ng/ml

2.  按下列体系配制反应混合液,混匀,加一滴矿物油,离心5秒
Template DNA        (20 ng)2 
buffer              2.0 ´10 μl
MgCl2(25 mM)        1.5 μl
lmPrimer F (10 mM)        0.2 μl
Primer R (10 mM)        0.2 μl
lmdNTPs(2 mM)        2.0 μl
Taq(5 U/μl)  2.0 μl
Add ddH2O  to    20 μl

3.  PCR反应循环条件设置:
95 ℃                     1 cycle
94 ℃   55 ℃  1'   72 ℃  1'30"   35 cycles
72 ℃                    1 cycle
4 ℃                       forever

溴酚蓝,混匀,短暂离心,取15 ml
 
4.  检测:加2 ml反应产物点样电泳;

5.  在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳;EB染色,紫外观察。
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