(1 ) 玻璃管的准备: 取内径1 . 5～2 mm, 长16 cm 玻璃管用 乙醇/ 盐酸为6/ 4 的溶液浸泡30 min , 再用蒸馏水冲洗, 烘干。 灌胶前用封口膜封住管的一端, 并固定。
(2 ) 凝胶的配制与电聚焦: 取尿素2 . 06 g , 加入0 . 75 ml 蒸 馏水, 0 . 75 ml 10%的NP-40 , 37 ℃水浴(不能超过37 ℃) , 待尿 素充分溶解后加入0 . 5 ml 的凝胶原液和两性电解质0 . 05 ml , pH3 . 5～10; 0 . 05 ml , pH4～ 6; 0 . 15 ml , pH6 ～8 , 再加入10 μl 10%l AP 和3 μl TEMED, 混匀后灌胶。在灌好的胶管的顶部覆 盖1 cm 的双蒸水, 室温聚合1 h 以上, 待胶聚合好后吸去上层水 溶液并加样30 μl , 再加入20 μl 样品覆盖液( 8 mol/ L 尿素, 1 . 5%两性电解质( 0 . 3% pH3 . 5～ 10 , 0 . 3% pH4～ 6 , 0 . 9% pH 6～8 ) , 5% NP-40 , 5%2-巯基乙醇) 和50 mmol/ L NaOH 至管 口, 待电泳。电极液为: 上槽( 负极) 50 mmol/ L NaOH, 下槽 (正极) 25 mmol/ LH3PO4 , 在室温下, 按200 V×15 min , 300 V× 20 min , 400 V× 30 min ,500 V× 30 min , 600 V×16 h 的程序进行 聚焦。
3. 取胶、pH 梯度的测定及胶条的平衡
聚焦结束后, 取出玻璃管, 吸去两端的溶液并以双蒸水清 洗, 然后用10 ml 注射器套上200 μl 的tip 头吸取一些水从进样的 一端轻轻将胶条打出。将要测定的胶条按每段1 cm 分成若干段 后, 按顺序装入盛有脱气的双蒸水的小瓶中, 放4 ℃ 冰箱过夜, 次日用pH 计分别测定各段的pH 值。对要进行第二向电泳SDSPAGE 电泳的胶条则必须放入平衡液(60 mmol/ L Tris-Cl pH6 . 8 , 2%SDS, 5%2-巯基乙醇, 10% 甘油, 0 . 05%溴酚蓝) 中平衡10 ～30 min (平衡后的胶条酸端染成淡绿色而碱端染成深蓝色)。 暂不进行第二向电泳的胶条可放入- 20 ℃保存数日。
4. 第二向SDS-PAGE 电泳
选用DDY-Ⅲ28D 型( 北京六一仪器厂生产) 电泳槽(规格 为200 mm×130 mm×1 mm, 双板) , 分离胶浓度13% , 浓缩胶 浓度5% , 分离胶长160 mm, 浓缩胶长40 mm ( 灌至玻璃板上 沿) , 灌好浓缩胶后在一端插入单孔梳, 以便加入蛋白质分子量 标准品。待胶聚合后, 将第一向平衡好的胶条平放于浓缩胶顶部 (避免胶条拉伸) 并用1% 琼脂糖( 用电极缓冲液配制) 封胶。 此时应注意避免胶条与浓缩胶上沿之间产生气泡( 可先用尖头滴 管将加热到70 ℃ 的琼脂糖在浓缩胶上沿薄薄地涂上一层, 立即 将平衡好的胶条平放于其上, 再用注射器针头挑动胶条使其结合 完好)。待琼脂糖凝固后拔出单孔梳, 加入适量用变性胶处理过 的marker , 加满电极缓冲液, 在冰箱中4 ℃ 电泳, 恒压200 V, 至溴酚蓝达胶底部为止( 约5 h)。
5. 染色与脱色
电泳结束后, 剥下胶板, 放入染色液( 0 . 05% 考马斯亮蓝 R-250 , 50%甲醇, 10% 甲酸40% 水) 中置室温2 h , 换脱色液 (慢脱色液: 7% 乙酸; 快脱色液: 30% 乙醇, 10%乙酸) , 脱色 至背景清晰。温度升高, 染色或脱色速度相对加快。脱色好后的 胶最好立即照相, 也可放入7%乙酸于4 ℃冰箱保存以随时照相。
