细胞表面标记的检测技术-活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备
活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
一、附录
1. DPBS （×10， 贮存液）
NaCl 80 g， KCl 2 g，蒸馏水加至1000 ml， Na2HPO4 11.5 g，临用时用蒸馏水1∶10稀释， KH2PO4 2 g
2. 洗涤液
DPBS 900 ml， FCS 50 ml（终浓度5 ％）， 4 ％ NaN3 50 ml（终浓度0.2 ％）
3. 固定液
DPBS 1000 ml， 葡萄糖 20 g（终浓度2 ％）， 甲醛 10 ml， NaN3 0.2 g （终浓度0.02 ％）
1. 制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）
2. 用10 ％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×106～1×107 /ml
3. 取40 μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50 μl） 的小玻璃管或塑料离心管，再加50 μl 1∶20（用DPBS 稀释）灭活正常兔血清， 4 ℃ 30 min
4. 用洗涤液洗涤2 次，每次加洗涤液2 ml左右， 1000 rpm×5 min
5. 弃上清，加入50 μl工作浓度的羊抗鼠（ 或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇， 4 ℃ 30 min
6. 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2 ml左右， 1000 rpm×5 min
7. 加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入 1 ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500 μl固定液）
8. FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（ 标本在试管中可保存5～7 天）
注意事项
1. 整个操作在4 ℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴 性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非 特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
