限制性内切酶克隆(Restriction Cloning)是一种常见的克隆技术，其中限制性内切酶(Restriction Enzymes)用于准备连接的插入物(Insert)和载体(Vector)，如下图，

SnapGene提供了一个模拟限制性克隆的直观界面。可以提前设想一个试验流程，这样在SnapGene上模拟只需要几秒钟就能搞定。快速发现克隆过程是否存在设计缺陷，并在真正试验进行前纠正它们。

 限制性克隆有哪些技巧？  限制性克隆虽然传统，但在很多应用场景中，它仍然是最好的方法之一。下面介绍一些基本技巧，会帮助你的克隆更顺利地进行。 General Tricks 

• 首先，也是最重要的是，进行的每一步都要小心谨慎。从长远来看，这会节省很多时间（避免从头来过）；

• 确保DNA非常干净。当准备载体或切除要插入的片段时，从大约2μg的DNA开始；

• 每次酶促反应后，用离心柱(spin-column)纯化DNA。在40 – 45μl的10 mM Tris（pH 8.5）中洗脱DNA，然后进行下一步反应；（注意，在用凝胶纯化DNA片段之前，不需要使用离心柱）

• 为了使效率最大化，建议设计流程时尽量减少步骤。例如，将钝端片段克隆到钝端载体上，如SmaI位点，比克隆到用Klenow或T4 DNA聚合酶钝化的位点效果更好；

• 在你不能肯定的时候，先用用凝胶提纯DNA片段。更纯净的原材料往往能产生更好的结果；

About Preparing the Vector 

限制克隆最常见的问题是，起始载体(starting vector)会在过程之后恢复。出现这个问题有两个原因：1)载体的不完全消化；2)切割后的载体与自身再链接(re‑ligation)。下面要介绍的技巧会帮助你最小化这些影响。

• 确保载体的消化完成。使用过量的限制酶（2μgDNA，约20 U），并消化约4小时。如果需要使用具有不同最佳反应缓冲液的两种酶切割载体，依次进行消化，并在两者之间进行离心柱(spin-column)纯化；

• 消化载体后（如需可blunting），然后用磷酸酶处理：在37°C下1小时5'overhangs，或在50°C下1小时，如果DNA有钝端或3'overhangs；

• 用离心柱除去磷酸酶(phosphatase)。通常不需要对载体进行凝胶纯化，因为磷酸酶处理将使产生的任何额外DNA片段失活；

*利用载体，确保消化和磷酸酶反应完成。将混合物彻底反复涡旋(vortex)，使任何微滴都无法逃脱酶处理。涡旋后短暂旋转是一个好主意，以确保在管子的侧面上没有残留。

About Preparing the Inserted Fragment 

• 对于插入片段的制备，“不完全消化”并不是一个严重的问题，因为片段的部分恢复是可以接受的。你可以使用相对较短的消化时间，对于双重消化，可以使用对一种或两种酶都不理想的反应缓冲液；

• 用凝胶纯化插入的片段。除了去除不需要的或不完全消化的DNA外，这个过程还去除了酶和小分子。用透照器观察DNA条带时，不要使用312 nm或以下的短波紫外线光，否则DNA会受到严重破坏。建议使用360-365 nm紫外线光；

• 如果插入的片段是通过PCR产生的，在进行任何限制酶切消化之前，需要先用凝胶或离心柱将其纯化。如果打算将钝端PCR片段（由聚合酶生成，如Pfu）克隆到经过磷酸酶处理的载体中，要确保PCR引物含有5'-磷酸(5′-phosphates)；

 About Ligation and Transformation 

• 用磷酸酶处理的载体进行对照连接，其中插入的片段被省略。这种对照连接应产生很少的转化子(transformants)，因为只有环状DNA分子才能有效地转化大肠杆菌(E.coli)，如果不与磷酸化片段连接，载体的重新环化就不会发生；

• 如果DNA仅具有粘性末端，在室温下连接~1小时左右。如果DNA有钝端，在室温下连接4小时左右，同时使用高浓度T4连接酶(high-concentration T4 ligase)；

About Minipreps and Diagnostic Digest 

• 如果与插入片段的连接所获得的转化子多于对照连接，那么几乎可以说克隆将正常进行，通常只需进行3-4次小量制备即可；

• 对小量制备进行诊断限制性消化时，要始终将起始载体包括在内作为参考标准；