SnapGene # TOPO®克隆简述及实例应用

我来到你的城市 2021-07-27 09:43:18 阅读: 2548

什么是TOPO®克隆技术?

TOPO®克隆(基于拓扑异构酶的克隆技术)不需要限制性内切酶或外源连接酶,从而提供了将新的PCR产物克隆到质粒中的极其简便快捷的方法。该技术依赖于互补的碱基对腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的基本能力来杂交并形成氢键。

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TOPO®克隆有哪些优势

1. 【高效】高达95%的克隆包含所需的插入

2. 【快速】室温反应,仅5分钟

3. 【轻松】简单的三步

4. 【被证实】超过20,000的引用

5. 【灵活】可提供有(或无)感受态细胞,并具有多种反应大小和格式,以适应你选择的聚合酶

*但同时也需要注意TOPO®克隆的缺点,只有很少的质粒骨架可用于TOPO®,并且自己创建TOPO®载体是不可行的。

简单三步实现TOPO®克隆

TOPO PCR克隆只需要三个简单的步骤。 简单地将PCR产物和TOPO克隆载体在提供的反应缓冲液中结合,等待5分钟,然后转化大肠杆菌菌株。使用TOPO克隆,可以省去连接酶介导克隆所需的额外时间、步骤和试剂。

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SnapGene如何模拟TOPO®克隆?

利用牛痘病毒拓扑异构酶I与3 '磷酸基共价结合的线性化载体,TOPO®克隆可以高效克隆PCR产物。SnapGene模拟了这种方法的三种不同变化,

  • TOPO®TA克隆(TOPO® TA cloning)使用线性化载体(Linearized Vectors,如pcDNA™3.4TOPO®)克隆3'-A突出端的PCR产物。这些PCR产物通常由Taq聚合酶产生;

  • Blunt TOPO®克隆(Blunt TOPO® cloning)使用线性化载体(例如pCR®-BluntII-TOPO®)来克隆具有平头突出端(Blunt Overhangs)的PCR产物。这些PCR产物通常由高保真聚合酶产生;

  • 定向TOPO®克隆(Directional TOPO® cloning)使用线性化载体(例如pET200 /D-TOPO®)以定向方式克隆PCR产物

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SnapGene通过自动化引物设计简化了TOPO®克隆。要设计TOPO®克隆过程,选择你想要扩增的DNA片段,然后从SnapGene软件中嵌入的列表中选择TOPO®克隆载体。然后,SnapGene将选择合适的引物

SnapGene可以模拟三种不同类型的TOPO®克隆。那么具体在SnapGene上如何操作呢?首先从定向TOPO®克隆开始,一起跟小编实际操作一下吧!

丰富资源库,自动引物设计

SnapGene提供所有商用TOPO®载体序列库,随时可以在SnapGene中使用。如果需要,SnapGene将自动设计适当的插入特异性引物,用于定向TOPO®克隆。

1. 打开“TOPO定向克隆对话框”

操作:点击Actions→TOPO®克隆→Directional TOPO®克隆… 打开“定向TOPO®克隆”窗口。

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2. 选择插入(Insert)

操作:“插入(Insert)”选项卡 - “插入源(Source of Insert)”菜单 -  “插入(Insert)”文件或 “浏览(Browse)”

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*选择所选序列中将被扩增以进行定向TOPO®克隆的区域。单击“地图”或“序列”视图中的特征以将其选中,或切换到“序列(Sequence) ”视图以选择精确区域。单击“插入方向(Orientation of insert)”按钮以设置所需的插入方向。

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Tips

如果你在打开并查看序列文件之前,单击Actions→TOPO®克隆→Directional TOPO®克隆…,开放序列会自动设置为“插入源(Source of Insert)”。

3. 选择Vector

操作:切换到“线性化矢量(Linearized Vector)”选项卡,然后从“商业线性化(Commercial Linearized)”定向TOPO®矢量列表中选择要使用的矢量。

4. 设计引物

操作:切换到“产物(Product)”选项卡,然后单击“选择PCR引物...”以设计新的插入特定PCR引物。

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*确认将扩增正确的区域,设置所需的引物Tm,然后单击“选择引物”。

Tips

  • SnapGene将设计适当的正向和反向引物来扩增插入物。正向引物将包含确保定向TOPO®克隆所需的"5'-CACC"基序;

  • 如果插入片段已经具有定向TOPO克隆所需的5' "CACC"基序,可以不要设计PCR引物。在这种情况下,在“插入”视图中,设置“插入源”,然后选择“直接用作模板(Use directly as the template)”。请注意,仅当序列中存在5' "CACC"主题时,“直接用作模板”选项才可用。

5. 确认预测的插入序列和连接产物

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操作:新设计的引物用来扩增插入序列。 正向引物将包含一个5' "CACC"基序,赋予TOPO®-mediated的插入物与载体连接的方向性。在“产物(Product)”选项卡中,切换到“序列”视图,并确认模拟的连接方向正确,并且在基于矢量的阅读框内。如果需要将核苷酸(nucleotides)插入正向或反向引物中以确保符合读框融合,请切换回“插入”面板并手动编辑引物序列。

最后不要忘记输入新序列的名称。

6. 给新的引物命名

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操作:切换到“插入”面板。编辑新设计的引物的名称。

7. 创建载体/插入序列

操作:在“创建产品”字段中,输入产品名称。(注意,默认情况下,SnapGene将仅输出最终的圆形插入/向量乘积)

可选:可以选中“插入”的“制作文件(Make File)”选项,以为中间PCR产物创建单独的新文件。为插入PCR产物文件输入适当的名称。

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Tips

SnapGene Directional TOPO®克隆工具可模拟PCR扩增和拓扑异构酶介导的连接步骤。你可以选择输出一个单独的文件来表示中间PCR产物

8. 订购引物

单击顶部工具栏中的“保存”按钮下拉菜单,然后选择以分隔的文本格式导出引物数据...,然后可将其用于引物订购。

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