SnapGene # 反向PCR

我来到你的城市 2021-07-27 09:46:21 阅读: 2111

反向PCR（Inverse-PCR）只是常规PCR的一种变体。由霍华德·奥克曼（Howard Ochman）及其同事于1988年一同开发。 在我们深入探讨反向PCR之前，让我们先了解下常规PCR和反向PCR的基本区别。如下图，在常规PCR中，目标DNA是已知的，我们是拥有该序列的信息的。这取决于引物被设计为扩增已知的互补DNA序列。 0.jpeg 而在两个不同的单链上在反向PCR中，DNA区域未知，至于基因组中插入哪种类型的DNA，我们没有任何信息。我们设计的引物与已知的DNA区域互补，不是向彼此延伸，而是使DNA彼此远离。如下图， 0 (1).jpeg 虽然两种PCR的Taq DNA聚合酶是相同的。在反向PCR中不需要特殊的DNA聚合酶。和DNA一样，引物是相互结合和合成的。

  反向PCR技术原理与常规步骤  

借助已知DNA区域的序列信息，可以使用已知DNA序列特异性引物将DNA或插入的DNA的未知侧翼区域扩增到循环酶反应中。DNA合成发生在已知的DNA区域之外。 限制性内切是对基因组DNA进行的，它只消化未知的侧翼区域，而不消化已知的DNA区域。连接未知DNA的侧翼区域会产生环状DNA，使用一组引物可以扩增该环状DNA。 实现反向PCR的整个过程一般分为5个步骤：

1. 鉴定具有侧翼未知DNA序列的已知DNA区域；

2. gDNA的限制性消化；

3. 连接消化的未知DNA片段；

4. 连接的环状DNA分子的扩增；

5. 未知DNA区域的测序；

  模拟反向PCR - 操作步骤  

1. 选择要删除的区域

 选择要删除的区域，例如，点击某个“feature” 0 (1).png

2. 反转选择

反转所选区域，单击“编辑” → “反转选择（Invert Selection）” 0 (2).png

3. 打开PCR对话框

0 (3).png

4. 选择引物

SnapGene支持自动选择引物，输入目标Tm，然后单击“选择引物（Choose Primers）”。 0 (4).png

5. 引物磷酸化

在“ PCR”对话框中，查看引物名称和磷酸化状态。通过单击5'磷酸化复选框之一，将磷酸基添加到至少一个引物中。 0 (5).png

6. 验证聚合酶选择

可以点击菜单中的“Creates Blunt Ends”选项进行验证。 0 (7).png

7. 命名扩增片段

在你准备好模拟反向PCR时，输入扩增片段的名称，然后单击“PCR”。 0 (6).png

8. 查看片段

线性片段会显示在新窗口中。 0 (8).png

9. 循环化片段

要循环化片段，单击“Actions”→“Circularize”... 0 (9).png 输入Circularized vector的名称，然后单击“Circularize” 0 (10).png

10. 查看产物

环状产物会显示在新窗口中。 0 (11).png

11. 查看历史记录

 要查看执行的步骤，可以切换到“历史记录”视图，非常方便。 0 (12).png

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