实用SCI绘图教程 | 如何用Photoshop计算WB/电泳的灰度值

我来到你的城市 2021-07-09 15:10:39 阅读: 3863

 

在western blot或者DNA电泳条带中,经常需要半定量统计条带的灰度值,比较常用的是用ImageJ这个软件来统计,但是如果不熟悉操作很容易得出错误的统计数据。本文从原理到操作告诉你如何用photoshop来统计灰度值

 

 

首先进行实际操作之前我们先来理解下什么叫做灰度值

如上图所示,灰度值就是从黑到白渐变过程中对应的数值。0代表黑色,255代表白色。

上图所示正常western blot条带和反向之后的条带。 上图的箭头分别指出了条带以及背景对应的区域。在正常条带中条带的值约为20,背景值为80;在反向图片中,条带的值 约为200,背景值为130。我们习惯了条带越粗亮灰度值越大,因此我们一般是对其进行反向之后测量。

 

在这里一定要去掉背景,至于为什么要去掉背景,在此不多说了(视频教程里将详细介绍)请看下面图片:

 

那么接下来开始我们今天的教程:

  1. 打开图片,因为图片有点倾斜,我们需要将其摆正,有两种方法进行拉直,第一种是将图层旋转(Ctrl+T,然后旋转至其摆正),另外一种是使用标尺工具,在左边快捷栏中安卓吸管工具不放,选择标识工具,然后在条带上面从左边点按住鼠标不放一直拖动到最右边,最后点击拉直图层即可。



  2. 点击菜单栏的“窗口”,选择直方图,弹出下面面板

    然后点击下图中右上角红色箭头所示,点击“显示统计数据”,得到如下:

    在上面的面板中,需要注意两个数值“平均值”和“像素”, 平均值即平均灰度值,像素即面积。

  3. 前面所说了,我们习惯越黑数值越大,那么我们需要对western blot图进行反相(快捷键Ctrl+I):

  4. 我们选择快捷面板中的“矩形框选工具”,选中第一个条带:

    框的位置不要太大,但也不要太小,此时,在直方图中出现了数值,我们把数值记录下来,只要记录 平均值 和像素 即可。

     

  5. 我们对第二个条带进行测量

    同样记录平均值和像素,这里需要注意的是,每次框选并不一定需要同样大小的区域。

  6. 全部测量之后,我们得到了如下的数据:、

  7. 注意上面有一个背景,这个背景是按照下面的方式测得的:

    在背景上框选一个比较大的能够代表背景的区域,记录背景的“平均值”,

  8. 最后在于计算,我们将每个条带的 “平均值” 减去 背景的 “平均值”,得到了实际的平均值,再乘以总面积就得到了该条带的总灰度值,我们将第一个条带设置值为1,得到其他条带相对条带1的值,并作图:

    通过上面的柱形图和实际western blot条带目测比较,基本符合实际情况。

  9. 假设我们没有去背景会是什么样的情况呢:

    可以看到,上面的相对值明显不符合实际情况。

 

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