qPCR中Cq的决定方式

刹那芳华 2021-07-16 09:41:15 阅读: 2900

qPCR中一般选择前面的3-15个循环的荧光值作为背景值,取其mean+ 10*SD作为阈值线(Fig 1),这叫做Threshold Method。目前市面上几乎所有主流机器都采用这个策略作为默认的决定方式。我们讲过阈值线要设立在指数扩增期,但在背景期时PCR反应仍然是指数扩增。目前检测荧光信号的CCD设备,其检测灵敏度差不多在10^10个荧光分子,即PCR反应产生出这个数量的荧光分子后才可以被CCD检测出信号[1]。PCR反应初期,荧光信号太弱,而且易受到CCD噪音的干扰,因此阈值线是一定要设立在背景之上的;那是不是只要高过背景且在指数扩增期就可以了?当然不是,考虑到极低拷贝数的样本,如果阈值线设得过高,则不会得到Cq值,因为扩增曲线刚刚扬起反应就结束了。因此总的原则是,阈值线要显著高于背景信号且尽可能的接近背景信号,由此才有这一条设立规则。

   

                       

Figure1. 标准的扩增曲线

       尽管大家公认这一原则,但并不意味着它是唯一正确的。事实上,阈值线的设立是比较主观的。可能存在这种情况:按照这一原则设立阈值线而得到的标准曲线其线性相关系数R2不尽如人意,而将阈值线向上移动后,反而R2值更接近于1。原因可能有以下几种情况:荧光干扰、反应体系中存在气泡或者机器噪音的增加,这都会导致背景漂移(忽上忽下),即变异系数的假性增加[2](Fig 2)。

 

Figure2. 背景漂升的非典型扩增曲线

      为解决这个问题,可以采用第二种决定方式:Fit-pointMethod。与采用baseline信号的Threshold Method不同,在log-scale视图模式下,Fit-point Method摒弃所有的背景信号点(noise band),阈值线就设立在noiseband之上并在指数扩增期即可[3]。这时肉眼是很容易判断指数扩增期的,即log-linear区域。一般情况下,不同的阈值线导致的结果差异并不大,都是可接受范围之内的(Fig3)。

 

Figure3. Fit-pointMethod中阈值线不同位置对结果的影响不显著[4]

       Threshold Method和Fit-point Method都是依赖于对指数扩增期的主观判断,且都是基于一个前提假设:相同的荧光信号对应相同的核酸数量。另外的一种尝试则从单个扩增曲线入手,仅从其构型特点出发即可得到扩增效率等信息,即2ndDerivative Maximum Method。在指数扩增期时荧光信号倍增速度是最快的,也就是扩增曲线的切线斜率是最大的,这个点是与DNA浓度相关的且是唯一的[3](Fig 4)。理想情况下,不同浓度的同一target其扩增曲线的拐点是一致的,但即使有差异,最终得到的标准曲线也是合理的。该方法在在一个批次实验中某几个样品扩增出现特殊情况(扩增构型与其它大多数样本不那么一致)时应用是更合适的。

 

Figure4. 2ndDerivative Maximum Method对于单个样本的判断更为准确合理

       综上所述,ThresholdMethod是最通用的Cq决定方式,但当baseline信号出现不稳定的时候,Fit-point Method可以将这种不稳定因素对于阈值线判断的影响降到最低。当没有标准曲线,但又要判断两个扩增曲线构型不同的样本的浓度倍比关系时,2ndDerivative Maximum Method是最合适的方法。

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