随着生物技术药物在人类疾病诊治和预防中的广泛应用，大大加速了动物细胞表达产品大规模高效培养的产业化进程。目前动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一，并以其研究的深入和进展推动了生物技术产业的迅速发展。近年来，蛋白质类药物的上市和带来的巨大经济效益，掀起了哺乳动物细胞培养的热潮。对于倍增时间长、对外界环境敏感、培养难度大的动物细胞，如何完善其培养工艺，提高细胞蛋白表达量，并有效投入大规模生产，成为国内外研究的热点。

随着市场对单克隆抗体药物这样的生物药的需求量不断的增加，从2005年至今，动物细胞培养的产能迅速的增加，现在全球的生物反应器总容量超过了2,000,000L，而且这个数字还再以每年大约20%-30%的速度增长，培养的产物终浓度也能够达到3-5g/L。动物细胞的大规模培养模式，在规模和技术方法上也越来越与微生物发酵培养产业相类似。

当前动物细胞大规模发酵工艺中的主流方向是搅拌式悬浮连续发酵工艺，特别是抗体等重组蛋白的规模化生产。在工业化生产中，悬浮培养工艺参数的放大原理和过程控制比其他发酵系统更易理解和掌握，因此在规模化动物细胞发酵生产中多选择此种工艺。悬浮发酵工艺（Suspension Culture）是指细胞自由悬浮于培养液内生长增殖的一种发酵方法。目前国际上该项技术发展较快，已逐渐趋向成熟。其中，以Genentech、IDEC、MedImmune、Merck等公司为代表的流加工艺生产规模达10,000L以上，此工艺具有操作简单、产率高、容易放大等优点；以Bayer、Genzyme、Genetic Institute等公司为代表的灌流工艺生产规模达500L以上，对生产一些表达不够稳定的产品尤为合适，但技术操作较为复杂、产物回收量大、培养液利用率低。悬浮发酵工艺适于许多工程细胞，如CHO、HEK293、杂交瘤细胞、SP2/0、NSO等。接下来就分别介绍一下两种培养工艺的特点。

1 灌流培养工艺（Perfusion Culture）

灌流培养工艺是一种常用的发酵工艺，多采用搅拌式细胞发酵系统，也可采用管式系统。在发酵过程中，不断向发酵罐灌流培养液，同时以相同流量流出。灌流工艺的优点是可在发酵过程中不断去除细胞碎片和副产物，降低细胞死亡后释放的各种酶类可能对产物的影响。同时，由于连续不断的灌流新鲜培养液而提供一个较恒定的培养环境，因此可获得较高的单位体积产率。由于灌流系统多采用细胞截留与回收系统，因而可实现细胞的高密度发酵。

目前，对于动物细胞培养方法选取，主要决定于细胞生长的特性和目的蛋白的性质。灌流培养的显著优势在于蛋白可以随着培养基及时地被分离出，蛋白在反应器内停留时间短，较少受到培养体系内各种水解酶的降解作用，有利于蛋白质量的提高。这一特点，对于化学性质不稳定的蛋白，例如酶、凝血因子等生产极为有利。而当细胞生长和蛋白质量不受培养方式限制时，例如对于化学性质相对稳定的抗体等药物生产而言，是选择细胞灌流培养还是补料批次培养，需综合衡量成本、效益、规模、风险、操作灵活性等因素。表1列举了运用灌流技术进行生产的部分生物药物。

表1 利用灌流技术生产的生物药物

当前多样化的生产环境中，生物技术公司越来越倾向于开发高度灵活和高效能的生产制造工艺。灌流培养作为实现提高稳定性低的重组蛋白产量的有效手段已广泛用于生物工程产业。灌流培养能够凭借小型生物反应器生产达到补料批次培养大规模生产所得的蛋白量，实现了培养规模小型化，增加了操作的灵活度。

1.1 细胞截留设备

随着悬浮细胞的大规模应用，悬浮细胞灌流培养技术也日益发展。细胞截留是悬浮细胞灌注培养的工艺要素之一，如何有效地截留细胞而不会对细胞造成损害成为工艺的重点和挑战。目前的细胞截留设备主要基于过滤、沉降、离心原理设计，包括旋转过滤器、涡流过滤器、倾斜沉降器、旋液分离器等。基于过滤原理设计的细胞截留设备，可以100%分离细胞，但滤膜容易被细胞碎片、消泡剂等堵塞，最终导致灌流培养终止。对细胞进行离心分离，可能引起细胞损伤。沉降和离心均不能完全截留细胞，细胞分离效果还会受到灌流速率的影响。除此之外，能否简单而有效地进行放大也成为大部分细胞截留设备应用的限制条件。

基于中空纤维柱截留原理而设计的交替式切向流（Alternating Tangential Flow，ATF）系统具有有效缓解滤膜堵塞，剪切力低等优点，是目前较优良的细胞截留设备。中空纤维柱通过一根管道与反应器相连，另一侧由高压空气泵入与真空泵抽负压的反复交替切换带动硅胶隔膜泵运动，使得动物细胞培养液通过中空纤维柱进出反应器。这一过程同时实现了低剪切力情况下充分地冲洗中空纤维柱，有效地降低了中空纤维柱滤饼堆积效应产生的堵塞影响。利用ATF系统，可以在较高的灌流速率下达到较高的细胞密度和较高的蛋白产量，还可以通过培养体积与中空纤维柱膜面积比有效放大到大规模生产中。

1.2 灌流速率的控制和优化

灌流速率是灌流工艺开发的又一要素。较高的灌流速率，培养基消耗量大，成本增加，细胞截留设备压力加大，产品大量稀释，纯化负担加重，不利于工业应用。一般在前期物料生产时，可以采用相对保守的灌流速率培养细胞，简单而快速地提供研究所需的材料，同时不用考虑蛋白降解的问题。在研发以及大生产过程中，应在不影响细胞生长和蛋白产量、质量的前提下，尽量降低灌流速率，实现低灌流速率下的稳态操作。

通常，在细胞对数生长期，应逐渐提高灌流速率，满足细胞的生长需要，尽快达到较高的细胞密度。进入平台期后，可结合调节温度、pH 等策略减缓细胞生长，降低灌流速率。灌流速率还可与在线糖耗、氧耗等参数偶联，进行动态控制，从而更加科学地进行细胞培养。但是这种做法需要严格控制细胞密度，防止细胞过度生长。

1.3. 灌流培养工艺的优势

灌流培养通过不断移出副产物和添加营养物来提供有利于细胞的稳定环境。与批次培养和补料批次培养相比，在高密度细胞环境下，灌流培养模式可以延长良好培养环境的时间，降低产物在反应器内的停留时间，这对于产品质量是有利的，对于性质不稳定的产品也是必要的，灌流培养通过不断移出副产物和添加营养物来提供有利于细胞的稳定环境。与批次培养和补料批次培养相比，在高密度细胞环境下，灌流培养模式可以延长良好培养环境的时间，降低产物在反应器内的停留时间，这对于产品质量是有利的，对于性质不稳定的产品也是必要的。

此外，目前生物技术公司需要快速调整生产能力以适应波动的市场需求，来自生物仿制药公司越来越激烈的竞争进一步推动成本的降低。与补料批次培养相比，灌流培养的另外一种优势是可以使用更小型的生物反应器，这意味着灌流培养可以减少清洁操作，其较小的反应体积可使用一次性生物反应器代替不锈钢反应器。灌流培养除了可以用于生产生物制品以外，还可以用于生产高密度种子库、细胞库或者是作为蛋白药物生产的研究工具。灌流培养可以以高细胞密度生产目的蛋白产物来补偿低细胞产率的不足，这将节省工艺开发的人力需求。

2 流加培养工艺（Fed-batch Culture）

流加培养工艺是采用细胞搅拌式发酵系统连续悬浮培养的方式。细胞初始接种的培养液体积一般为终体积的1/3至1/2，在发酵过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养液，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平，在细胞进入衰亡期后终止发酵，分离、纯化目标产品。

流加发酵工艺的关键主要取决于两大因素，即流加培养液的稀释率和生长限制性底物浓度。在此工艺中，通过氧气的限制可避免底物中限制性代谢产物浓度的增加，因而可获得更高的细胞密度和产量，目前动物细胞流加发酵工艺可超过1 个月，细胞密度大多在(0.5-2)×107/mL。

在流加培养过程中，由于营养成分的不断添加，其反应体积是不断变化的，特点在于：①流加培养是根据细胞的生长速率、营养物质的消耗速率和代谢副产物的积累来确定流加的营养物浓度及速率，通过测定底物浓度控制相应的流加过程，从而确保细胞生长环境的稳定性；②细胞生长动力学及能量代谢动力学与细胞的生命活动息息相关；③培养基的设计及培养条件的的优化是整个培养工艺的主要内容；④工业化生产中，悬浮流加培养的工艺参数放大原理及培养过程的控制较为简单，可以采用工艺参数的直接放大。

2.1. 流加培养中代谢副产物的调控

动物细胞培养过程中，常以葡萄糖和谷氨酰胺作为主要的能源物质，但是随着这些原料的消耗，容易积累大量的副产物乳酸、氨及甲基乙二醛，从而抑制细胞的生长代谢。培养液中乳酸的过量容易引起培养环境中渗透压增加，导致pH下降；氨的积累导致胞内UDP氨基己糖含量增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化，且氨离子能够穿透细胞膜，改变细胞内的pH，同时又可以抑制Gln代谢途径；而甲基乙二醛能够改变化合物的巯基和氨基，改变氨基酸、核酸等分子结构，从而影响蛋白产量。

通过控制葡萄糖和谷氨酰胺的浓度来减少代谢副产物是现如今流加培养过程中一个重要的手段。生产过程中，保持葡萄糖和谷氨酰胺浓度在一个较低水平，不仅使细胞的利用率得以提高，细胞液中乳酸和氨的浓度急剧下降，同时也降低了其他氨基酸的代谢。在杂交瘤细胞的流加培养过程中，将葡萄糖与谷氨酰胺的浓度分别由10和4mmol/L降低到0.3和0.2～0.4mmol/L，使得代谢副产物乳酸的浓度降低了42.7%。用果糖等六碳糖代替葡萄糖，用谷氨酸或缓慢水解的二肽代替谷氨酰胺也起到了相似的效果。随着基因工程在动物细胞培养中的逐渐深入，已成功构建出可以在无谷氨酰胺的培养基中正常生长的含谷氨酰胺合成酶基因的细胞，该技术大大降低了副产物氨的生成。

2.2 细胞凋亡及其基因调控

在大规模细胞培养过程中，细胞凋亡是细胞死亡的重要途径。研究发现，培养液中原料的耗尽或代谢产物积累都会诱导细胞发生凋亡。因此，在培养过程中控制流加营养成分的浓度和速率，避免氨等代谢产物的积累是十分必要的。另外，添加一定的凋亡抑制剂也是可行的。已经有科学家证明，金精三羧酸（ATA）是一种核酸酶抑制因子，具有抑制引起DNA裂解的核酸内切酶活性，其能够在不影响细胞增殖的前提下，抑制细胞的凋亡。Zn2+及各种氧化剂（如维生素E、细胞因子）等也可以起到抑制细胞凋亡的作用，不过需要注意的是抑制细胞凋亡的Zn2+浓度恰巧接近于对细胞有毒的Zn2+水平。

随着转录组学、蛋白质组学、代谢组学的迅速发展，对细胞增殖、代谢及蛋白翻译后修饰等过程的研究将更加深入和透彻，对宿主细胞的改造也将会有越来越多的思路和策略。

2.3 补料策略优化

合理的补料策略是以达到最大细胞密度、延长培养时间和提高单抗产率为目标，并综合考虑细胞的生理状态、营养物平衡和反复流加过程等因素。目前的补料策略主要有两种：离线补料和在线补料。前者是将补料培养基消耗与细胞生长、营养物质的消耗相偶联，通过离线检测对应物质的浓度预测补料培养基消耗来补料，该补料策略较为准确，但操作过程较为复杂，且容易因频繁取样而造成杂菌污染。后者是将培养基的消耗与可在线检测的指标氧消耗速率、葡萄糖等物质的浓度相联系，并借助计算机预先设定的公式预测补料培养基的消耗来补料，该补料策略工艺简单，但是在细胞进入平台期后，预测值与实际消耗量存在的偏差较大。然而这两种的补料策略实质是相同的，都是通过对细胞的生长预测进行补料，确保葡萄糖等营养物质的浓度维持在各自设定值附近。

2.4 流加培养过程检测与控制

流加培养的控制是培养成功的关键，其与微生物系统一样，可分为开环和闭环方法。在开环系统中，培养是根据最佳流加路线来补加，如最优控制理论模型。因此对于细胞生长和产物生成动力学模型的建立是十分必要的，这些模型可分为结构模型和非结构模型，关于杂交瘤细胞生长和单抗生成的非结构模型有许多报道。

由于流加培养过程中，随着细胞的增殖、底物的消耗、产物的生成及外部的供给，整个培养系统的状态一直在产生变化。一方面细胞离线取样测定需要耗费较长的时间，对于生物反应器相关参数的控制和细胞培养环境的优化无法实现有效、准确的指导；另一方面，细胞培养过程中取样次数太多容易引起杂菌污染，同时也增加成本。所以在线监测技术显得十分必要，它可以确保细胞处于一个适宜的培养环境，并减少杂菌污染带来的问题。

在细胞活力的检测中贝克曼Vi-CELL XR的细胞计数平台有效的解决了细胞计数的问题。准确的测定反应器中的细胞密度激活率在过程检测与控制中尤为重要，多样、均衡的营养控制是维持细胞在体外健康生长的前提。动物细胞流加培养过程中，常用的控制标准是保证关键性营养成分的浓度控制在合理范围之内的基础。细胞活力及细胞浓度的准确是基础中的基础，营养成分控制的依据是确保细胞处于高表达率、延缓细胞坏死及较为一致的糖基化等理想的培养状态。自动化流加培养过程中，通常对营养物质的浓度、代谢副产物的积累及细胞密度等实施持续检测与控制，有助于细胞生长与目标产物的生成。Vi-CELL XR可为其保驾护航。

流加培养工艺操作相对简便，可重复性强，较连续灌注模式减少了较多的操作环节，降低了污染的机会，有利于产品批次间的稳定性和过程成本的控制。但流加培养模式最大的缺点是产能受限于发酵罐的尺寸，为了提高产能只有建造更大的发酵罐。目前国际上主流抗体药物的生产工艺均为流加培养，建造规模已达万升级。由于流加培养过程可能产生的产品糖基化方式及分布不同于批量培养生产的产品，因此在培养基设计和流加策略的开发中也必须关注生物制品的质量，尤其是产品的糖基化。

我们相信，经过我国一大批从事动物细胞大规模发酵及生物制药研发的科技及管理人才的不懈努力，必将在“十三五”期间使得该系统的生产工艺和生产规模提升到一个崭新的高度，更快、更好、更强的发展我国生物制药产业。