详解细胞培养液

背着弓箭的小黑 2021-08-24 17:30:44 阅读: 280

现代生物技术均通过细胞作为载体来进行,无论是基因治疗、干细胞、克隆技术 都在细胞内进行的。细胞的生长需要一定的营养环境,用于维持细胞生长的营养基质称为培养基,即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质,就其 本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境, 使细胞在此环境中有生长和繁殖的能 力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分 主要有: 氨基酸、 水、 维生素、 碳水化合物、 无机离子及其他一些入核酸降解物、 激素等。 随着动物细胞大规模培养技术的迅速发展, 作为细胞培养领域中最基本的原料- 细胞培养基的用量也迅速增加, 被广泛应用于细胞生物学科和医学研究的各个领 域,如疫苗生产(人用疫苗如乙脑、狂犬、甲肝、乙肝、出血热、麻疹等,兽用 疫苗如口蹄、马立克、伪狂犬等) ,基因药物生产(如 EPO、TPA 等) ,临床用单 抗(如抗人肝癌单抗、抗人肺单抗、WT3)等。

第一节 水与平衡盐溶液

 

1、培养用水:体外培养的细胞对水质特别敏感,对水的纯度要求较高。培养用水 中如果含有一些杂质,即使含量极微,有时也会影响细胞的存活和生长,甚至导 致细胞死亡。用金属蒸馏器制备的蒸馏水,可能会含有某些金属离子,一般不作 为培养用水。 配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水 净化装置制备的超纯水。最好用龙头瓶贮存,存放时间一般不应超过 2 周。 2、缓冲溶液、生理盐水、平衡盐溶液:稍后介绍。

第二节 细胞培养基的基本要求

体外培养的细胞直接生活在培养基中,因此培养基应能满足细胞对营养成分、促 生长因子、激素、渗透压、pH 等诸多方面的要求。 

 

一、营养成分 

维持细胞生长的营养条件一般包括以下几个方面: 

1、氨基酸:是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要 12 种必须氨基酸:缬氨 酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸。此外还需要 谷氨酰胺,它在细胞代谢过程中有重要作用,所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成 的来源,同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。 体外培养的各 种培养基内都含有必需氨基酸。 

2、单糖:培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解,六碳糖是主要能源。此外六 碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高, 半乳糖最低。 体外培养动物细胞时, 几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源 物质。 

3、维生素:主要扮演辅酶、辅基的角色,必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、 泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素 B12 都是培养基常有的成分。 

4、无机离子与微量元素:细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素, 还需要微量元素,如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。 

二、促生长因子及激素 已证实:各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保 持细胞的状态(分化或未分化)具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长 有促生长作用,如胰岛素,它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一 类细胞有明显促进作用,如氢化可的松可促进表皮细胞的生长,泌乳素有促进乳 腺上皮细胞生长作用等。 

三、渗透压 细胞必须生活在等渗环境中,大多数培养细胞对渗透压有一定耐受 性。人血浆渗透压 290mOsm/kg, 可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在 320mOsm/kg 左右。 对于大多数哺乳动物细胞, 渗透压在 260-320mOsm/kg 的范围都适宜。 

四、pH 气体也是细胞生存的必需条件之一,所需气体丰要是氧和二氧化碳。氧 参与三羧酸循环,产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。一些细胞在缺 氧情况下,借糖酵解也可获取能量,但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时, 一般置细胞于 95%空气加 5%二氧化碳的混合气体环境中培养。 二氧化碳既是细 胞代谢产物,也是细胞所需成分,它主要与维持培养基的 pH 有直接关系。动物 细胞大多数需要轻微的碱性条件,pH 值约在 7.2~7.4℃在细胞生长过程中,随 细胞数量的增多和代谢活动的加强,二氧化碳不断被释放,培养液变酸,PH 值 发生变化。由于 NaHCO3 容易分解为二氧化碳,很不稳定,致使缓冲系统难以精 确地控制。故这一缓冲系统适合密闭培养。HEPES 结合碳酸氢钠使用,可提供更 有效的缓冲体系,主要是防止 pH 值迅速变动,但最大缺点是在开放培养或观察 时难以维持正常的 pH 值。造成 pH 波动主要是代谢产生的 CO2 ,在封闭式培养 过程中 CO2 与水结合产生碳酸,培养基 pH 很快下降。为解决这一问题,合成培 养基中使用了 NaHCO3-CO2 缓冲系统,并采用开放培养,使细胞代谢产生的 CO2 及时溢出培养瓶, 再通过稳定调节温箱中 CO2 浓度 (5%) 与培养基中的 NaHCO3 , 处于平衡状态。  

五、 无毒、 无污染 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力, 因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染(如细菌、真菌、支原体、病 毒等) 、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染(如抗体、补体) 。对于 天然培养基,污染主要来源于取材过程及生物材料本身,应当严格选材,严格操 作。对于合成培养基,污染主要来源于配制过程,配制所用的水,器皿应十分洁 净,配制后应严格过滤除菌。

第三节 天然细胞培养基

天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基, 如血浆、 血清、 淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培 养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐为合成培养基 所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清,另外各种组织提取液、促进细胞贴 壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。 血清(serum (serum)细胞培养的发展,培养基的质量又是关键,而培养基的主要成 

一、血清(serum 份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。 在动物血清 的应用中牛血清又是最为广泛的, 所以血清是医药生物技术产品中重要的原材料 之一。保证血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。 

1、 血清种类: 

目前用于组织培养的血清主要是牛血清, 血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因:来源充足、制备技术成熟、经 过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。 牛血清对绝大多数哺乳动物细 胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。 牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基, 含有丰富的细胞生长必须的营养成 份,具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血 清应取自剖腹产的胎牛;新牛血清取自出生 24 小时之内的新生牛;小牛血清取 自出生 10-30 天的小牛。显然,胎牛血清是品质最高的,因为胎牛还未接触外 界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。 血清的主要成分:血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物。

2、血清的主要成分

其组成成份虽大部分已知,但还有一部分尚不清楚,且血清组成及含量常随供血 动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、 多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等,这些物质对促进细胞生 长或抑制生长活性是达到生理平衡的。 对血清的成分和作用的研究虽有很大进展, 但仍存在一些问题。主要是: 第一:血清的成份可能有几百种之多,目前对其准确的成份、含量及其作用机制 仍不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识,这 给研究工作带来许多困难; 第二:血清都是批量生产,各批量之间差异很大,而且血清保存期至多一年,因 此, 要保证每批血清的相似性极为困难, 从而使实验的标准化和连续性受到限制; 第三:不能排除血清中含有易变物质,这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。 

3、血清主要作用: 

提供基本营养物质:氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细 胞生长必须的物质。 提供激素和各种生长因子: 胰岛素、 肾上腺皮质激素 (氢化可的松、 地塞米松) 、 类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮 生长因子、血小板生长因子等。 提供结合蛋白: 结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质, 如白蛋白携带维生素、 脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。 对培养中的细胞起到某些保护作用:有一些细胞,如内皮细胞、骨髓样细胞可以 释放蛋白酶, 血清中含有抗蛋白酶成分, 起到中和作用。 这种作用是偶然发现的, 现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。 因为胰蛋白酶已经被广泛 用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械 损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素 和离子,他们在代谢解毒中起重要作用,如 SeO3,硒等。 

4、细胞培养中使用血清的缺点 

血清成分复杂,虽含许多对细胞有利成分,也含有对细胞有害的成分,使血清有 几个明显的缺点: 对大多数细胞,在体内状态,血清不是它们接触的生理学液体,只是在损伤愈合 以及血液凝固过程中才接触血清, 因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正 常状态,血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长 (表皮细胞) 。 血清含一些对细胞产生毒性的物质,如多胺氧化酶,能与来自高度繁殖细胞的多 胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒 素等都会影响细胞生长,甚至造成细胞死亡。 动物个体不同, 血清产地、 批号不同, 每批质量差异甚大, 其成分不能保持一致。 取材中可能带入支原体、病毒,对细胞产生潜在影响,可能导致实验失败或实验 结果不可靠性。 血清的使用使得实验和生产的标准化困难, 其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生 物药品生产中分离纯化工作很难完成。 大规模生产中,血清来源越来越困难,价格昂贵,是构成动物细胞培养对生产成 本的主要部分之一。 

5、血清的质量标准: 

血清质量高低取决于两方面因素:一是取材对象,二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内,取材过程应严格 按照操作规程执行,制备出的血清要经过严格的质量鉴定。WHO 公布的《用动物 细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求: 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。 并应具备适当的监测 系统。 有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。 证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。 血清要通过滤膜过滤除菌,保证无菌。 无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染,有些国家要求无细菌噬菌体污染。 对细胞有良好的支持繁殖作用。 我国在对牛血清的质量 2000 年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出 比较严格的标准要求。包括蛋白质含量,细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆 菌噬菌体、细菌内毒素,支持细胞增殖检查。 血清质量的鉴定一般包括以下几个方面: 理化性质:如渗透压、pH 值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。 蛋白含量包括血清总蛋白含量 (不低于 35-45g/L) 球蛋白含量 、 (应小于 20g/L)、 血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标,血清中球蛋白主要是 抗体,球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。 微生物检测: 包括细菌、 真菌、 支原体、 病毒等。 特别是对支原体、 病毒的检测, 支原体是一种很小的微生物,可通过孔径 22u 的滤膜。支原体、病毒污染在光学 显微镜下难于察觉,细胞也能生长繁殖,但会影响实验结果。检测支原体的方法 很多,如培养法、PCR 法、荧光染色法、电镜观察法等。 促生长效果: 这是血清重要的特性之一, 应当以培养的细胞来检测。 有两种方法: 克隆形成率、贴瓶率测定法和连续传代培养法。

 (1) 克隆形成率测定:一般以悬浮生长的细胞为培养对象,按有限稀释法做克隆 

克隆形成率测定 化培养,将不同批号的血清配制成不同浓度的培养基,细胞也稀释成不同浓度, 接种到 96 孔板,每孔 200ul,培养一定时间,统计有克隆生长的孔,计算出百 分比,再与对照的标准血清相比较,就可看出不同批号血清间的区别。比较低的 浓度,更能观察出血清质量间的细微差别。

 (2) 贴瓶率测定:是以贴壁细胞为培养对象, 贴瓶率测定: 将细胞稀释至低密度, 接种至平皿, 

贴瓶率测定: 每皿 200 或 100 个细胞,以不同浓度的血清培养基培养,培养一定时间后弃培养 基,染色后统计集落数,计算出集落数占接种细胞数的百分比,同样再与标准血 清比较,判断血清质量高低。 

 (3) 连续传代培养法:是将细胞培养于 3 个一定体积的培养瓶中,待测血清配制 为 5%浓度,一般于第七天收集细胞,计数,取平均值,中间可以更换一次培养 基。连续测试三个周期以上,观察细胞生长状况,并将每次的计数结果与标准血 清的测试结果比较。 对于使用者,判断血清质量先从外观入手。好的血清应该是透明清亮,土黄色或 棕黄色,无沉淀或极少沉淀,比较粘稠。如发现血清浑浊、不透明、含许多沉淀 物,说明血清污染或血清中的蛋白质变性;若血清呈棕红色,说明血清中的血红 蛋白含量太高,取材时有溶血现象;如果摇晃时感觉液体稀薄,说明血清中掺入 的生理盐水太多。如果要进一步了解血清的质量,则应连续培养某些细胞,观察 细胞生长状况。 血清的使用与储存:正确的使用及保存血清,才能使血清发挥应有的作用。

 6、血清的使用与储存

使用前处理:大部分血清在使用前必须灭活处理,即 56℃30 分钟。灭活的目的 是去除血清中的补体成分,避免补体对细胞产生毒性作用。血清经过灭活也会损 失一些对细胞有利的成分,如生长因子,因此也有人提出血清不经灭活直接用于 培养,这样做的前提是确认血清中不含补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和 新牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。 储存条件: 血清一般储存于-20℃, 同时应避免反复冻融。 购买大包装的血清后, 首先要灭活处理,然后分装成小包装,储存于-20℃,使用前融化。融化时最好 现置于 4℃。融化后的血清在 4℃不宜长时间存放,应尽快使用。 使用浓度:自从有了合成培养基,血清就是作为一种添加成分与合成培养基混合 使用,使用浓度一般为 5-20%,最常用是 10%。过多血清容易使培养中的细胞 发生变化,特别是一些二倍体的无限细胞系,迅速生长之后容易发生恶性转化。 采购血清时,最好先从供应商处索取样品进行试验,选定一批后就要保留足够使 用 6 个月至 1 年的量,直至用另一批经过预先试验的样品代替。 

二、胚胎浸出液 胚胎浸出液(embryonic extract)是早期动物细胞培养中应用的天然培养基,现 已很少使用。 

三、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)为乳白蛋白经蛋白酶和 肽酶水解的产物,含有丰富的氨基酸,是常用的天然培养基,可用于许多细胞和 原代细胞的培养。


第四节 合成细胞培养基

合成培养基是根据天然培养基的成分,用化学物质模拟合成、人工设计、配制的 培养基。它有一定的配方,是一种理想的培养基。目前合成培养基多达 10 多余 种,有的培养基仍在不断进行改良。早期组织培养是利用天然培养基,目前合成 培养基已经成为一种标准化的商品,从最初的基本培养基发展到无血清培养基、 无蛋白培养基,并且还在不断发展。合成培养基的出现极大的促进了组织培养技 术的普及发展。 

一、基本组分 

基本培养基包括四大类物质:无机盐、氨基酸、维生素、碳水化 合物。 无机盐:CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。对调节细胞渗透压、某些酶 的活性及溶液的酸碱度都是必须的。 氨基酸:缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸 (L 型)。它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料,不能由其他氨基酸或糖类转 化合成。除此之外,还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用, 对细胞的培养特别重要,能促进各种氨基酸进入细胞膜;它所含的氮是核酸中嘌 呤和嘧啶的来源,还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。细胞 需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。 在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是:谷氨酰胺在溶 液中很不稳定,故 4℃下放置 1 周可分解 50%,使用中最好单独配制,置-20℃冰 箱中保存,用前加入培养液中。 维生素:是维持细胞生长的一种生物活性物质,在细胞中大多形成酶的辅基或辅 酶,对细胞代谢有重大影响。脂溶性维生素(A、D、E、K)常从血清中得到补充。 水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和 B12。维生素 C 也是不可缺少的,对具有合成胶原能力的细胞更为重要。

碳水化合物:是细胞生命的能量来源,有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有 葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。体外培养动物细胞时,几乎所有培养基 或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。 葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用:乳酸是葡萄糖不完全氧化的产物。研究表明,体 外培养条件下 95%的葡萄糖转变为乳酸,这降低了营养物质的代谢效率,降低 培养基 pH 值,增加渗透压。在氧气供给不足的情况下,NADH 转运系统苹果酸- 天冬氨酸穿梭系统活性低而不能将糖酵解产生的 NADH 氧化磷酸化为 NAD+,细胞 只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脱氢酶将糖酵解产生的丙酮酸与 NADH 反 应生产乳酸和 NAD+,从而保证了糖酵解的顺利进行。另一个可能的解释是连接 糖酵解与 TCA 循环的特异性酶如丙酮酸脱氢酶复合物、 磷酸丙酮酸羧化酶激酶和 丙酮酸羧化酶活性低下,直接导致糖酵解与 TCA 循环的失衡。因此体外培养条件 下,葡萄糖主要经糖酵解降解,产生过量的乳酸。减少乳酸生产最常用的方法是 限制培养基中葡萄糖的含量,但葡萄糖含量过低可造成细胞营养供应不足,细胞 生长抑制。该方法需要对葡萄糖的消耗与需求、乳酸的生产速率以及目的蛋白的 表达量等参数进行综合考虑方可应用。 在目前常用的培养基中,葡萄糖和谷胺酰胺是体外培养动物细胞的主要能源,其 能量代谢通路与体内完全不同, 表现为葡萄糖主要经糖酵解途径为细胞提供能量, 谷胺酰胺大部分通过不完全氧化途径,另一小部分通过完全氧化为细胞供能。因 此,适当的调整细胞内的代谢途径,使之能促进细胞的快速生长和产物合成,同 时减少代谢抑制物的生成是行之有效的一种策略。 许多动物细胞如 CHO、BHK 和杂交瘤细胞对营养物质葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利 用很快。然而对于细胞生长而言,二者的快速利用并非细胞必需;相反相当一部 分转化为代谢废物乳酸和氨,以及一些非必需氨基酸如丙氨酸,脯氨酸。其中, 乳酸和氨是两种主要代谢废物,其积累可影响细胞生长以及产品质量。减少这两 种代谢产物的积累,是大规模细胞培养技术研究的重要方向。 氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺产生的。 限制培养基中谷氨酰胺的含量亦是减少氨生 成的常用方法。 除了以上与细胞生长有关的物质以外,培养基中一般还要加入酚红(当溶液酸性 时 pH 小于 6.8 呈黄色;当溶液碱性时 pH 大于 8.4 呈红色) ,一种 pH 指示剂。 在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶两类)以及氧化还原剂 (如谷胱甘肽)等。有的培养液还直接采用了三磷酸腺苷和辅酶 A。 

二、常用细胞培养基 

(1)MEM 细胞培养基系列 

(2)DMEM 细胞培养基系列 

(3)RPMI-1640 细胞培养基系列 

(4)199 细胞培养基系列 

(5)水解乳蛋白细胞培养基 

(6)欧氏平衡盐 

(7)F-10,F-12 细胞培养基系列 

(8)其它类型细胞培养基 

三、干粉培养基的配制 

配制培养基要注意以下问题: 认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分,常见的有 NaHCO3、谷氨酰 胺、丙酮酸钠、HEPES 等。这些成分有些是必须添加的,如 NaHCO3、谷氨酰胺,有些根据实验需要决定。 配制是要保证充分溶解,NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才 能添加。 配制所用的水应是三蒸水,离子浓度很低。 所用器皿应严格消毒。 配制好的培养基应马上过滤,无菌保存于 4 度。 液体培养基主要是为了科研工作的方便而设计的培养基, 它是一种灭菌后保证无 菌的溶液,必要时可制成无内毒素等的溶液,可节省科研人员的工作量。 配制方法 在一个尽可能接近总体积的容器中加入比预期培养基总体积少 5%的双蒸水。 在室温(20℃到 30℃)的水中加入干粉培养基,轻轻搅拌,不要加热。 水洗包装袋的内部,转移全部的痕量干粉到容器内。 加 NaHCO3 到培养基中。 用双蒸水稀释到想要的体积,搅拌溶解。注意不要过分搅拌。 通过缓慢搅拌加入 1N NaOH 或 1N HCL 调节 pH 值, 由于 pH 值在过滤时会上升 0.1 到 0.3,因而调节 pH 值使它比最终想要的 pH 值低 0.2 到 0.3。培养基在过滤前 要保持密封。

第五节 无血清技术及其培养基

经历了天然培养基、合成培养基后,无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培 养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本,简化分离纯化步骤,避免 病毒污染造成的危害。 无血清培养基(serum medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在 无血清培养基(serum free medium,SFM): 体外较长时间生长繁殖的合成培养基。 但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组 分。 虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的 要求,但对有些实验却不适合,如观察一种生长因子对某种细胞的作用,这时需 要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子;又如需要测 定某种细胞在培养过程中分泌某种物质(抗体、生长因子)的能力;或者要大规 模的培养某种细胞,以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生 物科学工作者努力的目标。 上海恒利安生物科技有限公司已成功开发了商业化的 多种无血清培养基,可满足众多厂商的需求。 无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。 

一、无血清培养基的基本配方 

用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时, 多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长; 而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时,由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子 如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白,细胞往往以悬浮形式生长。 添加组分包括以下几大类物质:

 (1)促贴壁物质:许多细胞必须贴壁才能生长,这种情况下无血清培养基中一定 要添加促贴壁和扩展因子,一般为细胞外基质,如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它 们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子, 对许多细胞的繁殖和分 化,起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化,这些细胞 包括成纤维细胞、 肉瘤细胞、 粒细胞、 肾上皮细胞、 肾上腺皮质细胞、 CHO 细胞、 成肌细胞等。

 (2)促生长因子及激素:针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞 生长、维持细胞功能的重要物质,有些激素是许多细胞必不可少的,如胰岛素。

 (3)酶抑制剂:培养贴壁生长的细胞,需要用胰酶消化传代,在无血清培养基中 必不可少须含酶抑制剂,以终止酶的消化作用,达到保护细胞的目的。最常用的 是大豆胰酶;抑制剂。

(4)结合蛋白和转运蛋白:常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添 加比较大,可增加培养基的粘度,保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无 血清培养基都含有牛血清白蛋白。 

(5)  微量元素: 硒是最常见的。 

二、使用方法:

目前,血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物,尤其是在原 代培养或者细胞生长状况不良时,常常会先使用有血清的培养液进行培养,待细 胞生长旺盛以后,再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适 应过程, 一般要逐步降低血清浓度, 10%减少到 5%, 1%, 从 3%, 直至无血清培养。 在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化,是否有部分细胞死亡,存活细 胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。 在实验后这些细胞一般不再继续保留, 很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。 细胞转入无血清培养 之前,要留有种子细胞,种子细胞按常规培养于含血清的培养基中,以保证细胞 的特性不发生变化。 为了使细胞适应无血清培养,关键的是使所培养细胞: 处于对数生长中期 >90% 活细胞率 适应时以较高的起始细胞接种 有两种方法使细胞适应无血清培养基(SFM): 直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基(SFM)中。 

1、直接适应 一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应,接 种细胞密度应该:2.5×105~3.5×105 细胞/ml。当细胞密度达到 1×106~3×106 细胞/ml 时,传代培养细胞。当细胞密度在培养 4 到 7 天后达到 2×106~4×106 细胞/ml 时,细胞完全适应了无血清培养基。每隔 3~5 天,当细胞密度达到 1×106~3×106 细胞/ml,细胞活率在 90%时,贮备的适应了无血清培养基的细 胞培养物应该再次传代培养。 连续适应— (SFM) 

2、 连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基 中,与直接适应相比较,连续适应趋向对于细胞更加温和一些。 以 2 倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到 75%有血清培养基:25%SFM 混合培养基中,传代培养。 当细胞密度>5×105 细胞/ml 时,以 2×105 到 3×105 细胞/ml 细胞密度,在有 血清培养基:SFM 为 50∶50 的混合培养基中传代培养。 以 2×106 到 3×106 细胞/ml 细胞密度,25%有血清培养基和 75% SFM 中传代培 养。 当细胞密度达到 1×106 到 3×106 细胞/ml(接种后 4 到 6 天) ,在 100%SFM 培 养基中传代培养。 每隔 3 到 5 天, 当细胞密度达到 1×106 到 3×106 细胞/ml, 细胞活率在 90%时, 贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。 建议备份前一次混合培养的培养物,直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每 一次减少血清前,可能需要在 SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。 在适应过程中,最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注 意,与有血清培养基相比,大部分 SFM 包含非常少的蛋白质,因而更易于受外界因素的影响。 细胞培养适应替代血清:许多细胞利用连续适应方法能很好的适应,用包含 FBS 的的培养基和包含有替代血清的培养基 1∶1(v∶v)的混合培养基培养细胞。 通过下列的混合培养基的方式, 连续几代减少当前培养基的量: 1∶2, 1∶4, 1∶ 16 和 100%替代培养基。每次适应改变血清比例时,传代细胞 2 到 3 次。 培养可以直接从 FBS 转换到替代血清。 一开始就使用相同于 FBS 的浓度的替代物 或血清,生长的延迟可能会发生,允许进行 2 到 3 次的传代,使生长率恢复到 以前的水平。 特别需要强调的是:配制无血清培养液必须使用高质量的水,如石英玻璃蒸馏器 经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。 因为无血清培养基缺乏了血清中天然成 分中和毒素、保护细胞的大分子,既便水中的有毒物质含量甚微,也可能对细胞 产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。 

三、使用无血清培养基的优点 增加确定性 性能更加一致 容易进行纯化和下游加工 细胞功能的精确评估 增强生长和/或产量 生理反应性的较好对照 增强细胞内中介物的检测。

第六节 无蛋白培养基与限定化学成分培养基

midium,PFM) :即不含有动物蛋白的培养基。 

一、无蛋白培养基(protein free midium,PFM) 无蛋白培养基( : 无血清培养基仍含有较多的动物蛋白,如胰岛素,转铁蛋白、牛血清白蛋白等。 从生物技术发展的趋势来看,不含动物蛋白的培养基又广泛的应用前景,许多利 用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体, 如果再生长过程中使用了含有 动物蛋白质的培养基,纯化过程就比较复杂,最终要达到一定的质量标准也有一 定的难度。无蛋白培养基就是为了适应这发展趋势而出现的,许多无蛋白培养基 添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。市场上已有适合多种细胞 生长的无蛋白培养基。 限定化学成分培养基(chemical medium,CDM): 

二、限定化学成分培养基(chemical defined medium,CDM):是指培养基中的素 有成分都是明确的,它同样不含有动物蛋白,同样也不是添加了植物水解物,而 是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物,如短肽、植物激素等。这种培养 基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于 293 细胞、CHO 细胞、杂交 瘤细胞生长的 CDM 问世, 上海恒利安生物科技有限公司生产的水解乳蛋白培养基 就属于 CDM。

第七节 其他细胞培养用液

在细胞培养过程中,除了培养基外,还经常用到一些平衡盐溶液、消化液、pH 调整液等。 平衡盐溶液( solution,BSS) :主要是由无机盐、葡萄糖组 

一、平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS) : 它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持 pH 稳定及提供简单的营养。主要用 于取材时组织块的漂洗、 细胞的漂洗、 配制其他试剂等。 最简单的 BSS 是 Ringer。 D-Hank's 与 Hank's 的一个主要区别是前者不含有 Ca2+、Mg2+,因此 D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle 平衡液含有较高的 NaHCO3(2.2g/L),适合于 5%CO2 的培养条件,Hank's 平衡液仅含有 0.35g/L NaHCO3,不能用于 5%CO2 的环境, 若放入 CO2 培养相,溶液将迅速变酸,使用时应注意。 配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有 Ca2+、Mg2+,应当首先溶 解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。 

二、消化液:取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液,传 代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来, 常用的消化液有胰酶 (Trypsin) 溶液和 EDTA 溶液,有时也用胶原酶(collagenase)溶液。  

1、胰酶溶液:胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示,常见有 1:125 和 1:250, 即一份胰酶可消化 125 或 250 份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成 0.1-0.25%浓度,配制时要用不含 Ca2+ 、Mg2+及血清的平衡盐溶液(如前面的 D-Hank's) ,因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳 pH 是 8-9,配制胰酶溶液应将液体调至 pH8 左右,充分溶解,过滤除菌。过滤后可 以再调只 pH7.5,也可不调。 使用细胞清洗液配制胰酶消化液:含 0.5%胰酶的细胞清洗液(100ml 细胞清洗液 加 0.5g 胰酶) ,过滤除菌,分装于 4 度保存。 溶液: EDTA 溶液也常用来解离细胞, 它的作用机制是破坏细胞间的连接。 

2、 EDTA 溶液: 对于一些贴壁特别牢固的细胞,还可以用 EDTA 和胰酶的混合液进行消化。EDTA 溶液的使用浓度为 0.02%,配制时应加碱助溶,配制后可过滤除菌,也可高温消 毒灭菌。 

3、胶原酶溶液:胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用,胶原酶作用的对象 是胶原组织,因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为 0.1-0.3mg/L 或 200000U/L,作用的最佳 pH 为 6.5。胶原酶不受 Ca2+ 、Mg2+及血清的抑制, 配制时可用 PBS。 

三、pH 调整液:常用的有 HEPES 液和 NaHCO3 溶液。 

1、NaHCO3 溶液:NaHCO3 是培养基中必须添加的成分,一般情况下按说明书的要 求准确添加,以保证培养基在 5%CO2 的环境下 pH 达到设计标准。如果是封闭式 培养,即不与 5%CO2 的环境发生交换达到平衡,所使用的培养基就不能按照说明 书所要求加入 NaHCO3。此时常用 5.6%或 7.4%的 NaHCO3 溶液调节培养基,使之 达到所要求的 pH 环境。 

2、HEPES 溶液:是一种弱酸,中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸,对细胞无毒性, 主要作用是防止培养基 pH 迅速变动。在开放式培养条件下,观察细胞时培养基 脱离了 5%CO2 的环境,CO2 气体迅速逸出,pH 迅速升高,若加了 HEPES,此时可 以维持 pH7.0 左右。一般在进行克隆化培养时要添加 HEPES。 

四、抗生素:常用的是青链霉素,俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性 菌有效,链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌 污染。 通常使用青霉素终浓度 0.007-0.008g/100ml,链霉素终浓度 0.01g/100ml。 一般配制成 100 倍浓缩液,可用 PBS 或培养基配制。 谷氨酰胺补充液: 

五、谷氨酰胺补充液:谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用,合成培养基中都 要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解,4℃下放置 7 天即可分解约 50%,所以都是在使用前添加。配制好的培养液(含谷氨酰胺)在 4℃放置 2 周 以上时,要重新加入原来量的谷氨酰胺,故需单独配制谷氨酰胺,以便临时加入 培养液内。谷氨酰胺使用终浓度为 0.002mol/L。一般配制为 100 倍浓缩液,即 浓度为 200mmol/L(29.22g/L) ,配制时应加温 30℃,完全溶解后过滤除菌,分装至小瓶,储存于-20℃。使用时,在每 100ml 培养液中加入 0.5~2ml 谷氨酰胺 浓缩液,终浓度为 1~4mmol/L。

 二肽谷氨酰胺( 丙氨酰- 谷氨酰胺) 

六、二肽谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺) 在细胞培养液中 L-谷氨酰胺是大部分细胞培养基的基本成分;而 L-谷氨酰胺是 一种并不稳定的氨基酸,在中性的水溶液中会自发降解;需要频繁地补加 L-谷 氨酰胺。因而在培养操作过程中经常: 

(1)频繁打开盖子,增加了破坏无菌状态的可能性; 

(2)过多的追加 L-谷氨酰胺,增加了培养基中氨的毒性水平。 二肽谷氨酰胺在细胞培养中稳定而不降解,可高压灭菌,释放毒性氨最少! 二肽谷氨酰胺在细胞内被氨肽酶(E.C.3.4.11.2)所水解,产生 L-谷氨酰胺和 L-丙氨酸;因此在大部分细胞系统中二肽谷氨酰胺就可以象 L-谷氨酰胺同样有 效地被利用。 二肽谷氨酰胺是最优替代物, 它无需适应; 既可用于贴壁细胞培养, 也适合于悬浮细胞的培养。

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