细胞的冻存

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。

因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。通常采用甘油或二甲基亚砜（DMSO）作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

1. 所需材料 超低温冰箱或液氮罐

· 0.25%胰蛋白酶

· 含10%～20%的血清培养液

· DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)

· 2mL专用细胞冻存管

· 吸管、离心管、喷灯、冻存管架

2. 贴壁细胞的冻存

1). 选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入等量完全培养基终止消化。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，5分钟)。

2). 去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，加入10%的DMSO，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。

3). 将上述细胞分装于冻存管中，将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。

4). 先将冻存管置入置于4℃/30 min，再转入-20℃/2-h后，再放入-80℃冰箱冷冻过夜，次日保存到液氮罐中。

注：细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一支冻存管的细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。

3. 悬浮细胞的冻存

1). 直接将细胞收集到离心管

2). 1000rpm离心5min，弃上清

3). 以生长培养基（含20%胎牛血清）或100%胎牛血清重悬细胞至终浓度约107/ml，加入10%的DMSO。

4). 以每管1ml分装至冻存管中。

5). 置于4℃/30 min，再转入-20℃ 2h后，再放入-80℃冰箱冷冻过夜，次日保存到液氮罐中。

4. 液氮罐使用注意事项

1). 初次使用前检查容器内胆是否清洁干燥，外部有无凹陷及严重碰伤，如有轻微凹陷及碰伤，经试验其蒸发性能不变，仍可继续使用，如性能下降，应停止使用，避免经济损失。

2). 液氮容器应放在阴凉干燥处，应有良好的通风，不应放置在靠近热源，阳光直照，以及风口处，严禁放置液氮容器的房间紧闭门窗，以免室内因液氮蒸发使氧气含量下降，造成呼吸困难。

3). 只能用于充装液氮，冻存细胞和病毒用，严禁充装液氧等易燃易爆及腐蚀性液体，以免产生猛烈燃烧、爆炸或对容器产生腐蚀。

4).液氮是超低温液体（-196℃），在充装时，要穿长袖工作服、带皮手套，以避免液氮飞溅造成冻伤。

5).贮存容器不得作贮运容器使用。若运输液氮。必须使用B型贮运容器。因此类容器有特殊支撑结构,坚固可靠不易损坏。

6). 液氮容器在使用过程中，每天都应随时检查容器的使用情况，如发现容器瓶盖上和上部有水珠或结霜情况，说明容器质量出现问题，应立即停止使用。

7).存入取出样品要标记，拿取东西要轻拿轻放。